氯雷他定糖漿劑的抑菌效力考查

呂楊蘭

三明市檢驗檢測中心，福建 三明 365000

氯雷他定為抗組胺藥，主要用于緩解過敏性鼻炎有關的癥狀。藥物制劑常因本身沒有抑菌特性或者抑菌效力比較弱，使用過程中易造成微生物的污染，因此，大部分藥物一般為獨立包裝，使用過程中不容易引起污染，而本次試驗所用檢品為多劑量糖漿劑，患者使用過程中需要多次開啟，增加了污染的概率。為了避免微生物污染所帶來的危害，廠家一般會在藥物制劑中添加適宜的抑菌劑［1］。

2020 年版《中國藥典》四部通則0116 糖漿劑中有規定［2］，如果制劑處方中需要加入抑菌劑，除了另有規定外，其抑菌效力需符合通則1121 項下的規定。可見，對氯雷他定糖漿劑抑菌效力的測定是其質量控制中的一項重要指標［3-4］。廠家根據其特性添加了不同濃度的苯甲酸鈉作為抑菌劑。受該藥廠的委托，建立測定氯雷他定糖漿劑抑菌效力的方法，并檢驗廠家提供的三批藥品是否符合要求，進而對廠家確定出適宜的抑菌劑及合理添加量提供幫助。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

YXQ-50G 壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠），BS1360-Ⅱ-A2 生物安全柜（北京東聯哈爾儀器制造有限公司），SPX-150B-Z 細菌培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），LRH-325A霉菌培養箱（廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）。

1.2 菌種

大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］，上述標準菌株全部來自中國食品藥品檢定研究院，工作用菌株為凍干粉，第0 代。

1.3 供試品

氯雷他定糖漿劑樣品1（批號2004F-01-082，規格60 mL，抑菌劑0.8 mg/mL）；氯雷他定糖漿劑樣品2（批號2004F-01-083，規格60 mL，抑菌劑1.2 mg/mL）；氯雷他定糖漿劑樣品3（批號20210301，規格60 mL，抑菌劑1 mg/mL）。以上樣品使用的抑菌劑均為苯甲酸鈉。

1.4 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）（北京三藥科技開發公司，批號210123）；胰酪大豆胨瓊脂對照培養基（中國食品藥品檢定研究院，批號135025-202103）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）（廣東環凱微生物科技有限公司，批號 1095501）；沙氏葡萄糖瓊脂對照培養基（中國食品藥品檢定研究院，批號135013-201703）；pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（廣東環凱微生物科技有限公司，批號1093561）；胰酪大豆胨液體培養基（TSB）（北京三藥科技開發公司，批號210129）；沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）（北京三藥科技開發公司，批號2010132）。經驗證培養基的適用性符合規定。

2 方法與結果

2.1 菌落計數方法適用性試驗

2.1.1 菌懸液的制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的凍干粉適量加入到TSB 培養基，33 ℃培養24 h 備用。取白色念珠菌凍干粉適量加入SDB，23 ℃培養48 h 備用。取黑曲霉的沙氏葡萄糖固體斜面培養物，加5 mL 含0.05%（mL/mL）吐溫-80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗下霉菌孢子［5-6］，作為原液備用。

2.1.2 菌落計數方法的驗證在進行抑菌效力檢查前，首先應確保菌落計數方法的可行性。此次計數方法的驗證按照《中國藥典》2020 年版四部通則“1105”微生物計數法進行［2］。（1）試驗組。取樣品10 mL 加至90 mL 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，制成1∶10 供試液。取“2.1.1”項下制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌液各0.1 mL分別加入至1∶10供試液9.9 mL，混勻，使得每毫升稀釋液中細菌菌數均應不大于100 cfu，立即取1 mL 此稀釋液注入平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基；另取上述白色念珠菌及黑曲霉試驗菌液各0.1 mL 分別加入至1∶10 供試液9.9 mL，混勻，使得每毫升稀釋液中霉菌菌數均應不大于100 cfu，立即分別取1 mL 此稀釋液注入平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基。每種菌平行制備2 個平皿。分別按規定溫度及時間培養，測定其菌落數。（2）菌液對照組。取試驗組相同的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌及黑曲霉5 種菌懸液各0.1 mL 分別加入至pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，混勻。分別取1 mL 注入平皿，傾注胰酪蛋白胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基。每種菌平行制備2 個平皿。按規定溫度及時間培養，測定其菌落數。（3）供試液對照組。取試驗組項下的1∶10 供試液1 mL 注入平皿，傾注胰酪蛋白胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基。每種培養基平行制備2 皿.按規定溫度及時間培養，測定供試液本底菌數。（4）陰性對照試驗。取pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 mL，按試驗組操作。

2.1.3 結果回收率計算試驗組平均菌落數減去供試液對照組平均菌落數的差與菌落對照組平均菌落數的比值。經過驗證，每株菌落回收率均大于50%，符合2020 年版《中國藥典》要求［2］，平皿法即可作為菌落計數方法。

2.2 抑菌效力試驗

2.2.1 接種菌液菌數測定在進行抑菌效力試驗前，接種的菌懸液需要進行菌數測定。用0.9%無菌氯化鈉溶液將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的孢子菌懸液分別進行10 倍稀釋，取10-5、10-6、10-7三個稀釋級的稀釋液各1 mL 至平皿中，每個稀釋級平行制備2 個平皿，分別加入胰酪大豆胨瓊脂培養基或者沙氏葡萄糖瓊脂培養基，用平皿法測定菌數。結果見表1。

表1 試驗菌菌液計數結果（cfu/mL）

2.2.2 供試品接種本次廠家提供的氯雷他定糖漿劑的包裝，容量足夠用，無需另換其他容器，同時包裝容器也能夠保證按無菌操作要求接入試驗菌及后續試驗，為了使接種的菌懸液與樣品充分混合均勻，分別取3 個批次的樣品（包裝規格60 mL）各兩瓶，移去10 mL 樣品后，每批樣品分別接種3 種細菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌)和2 種真菌(白色念珠菌、黑曲霉)，分別依次接種菌懸液各500 μL，使其最終菌懸液的濃度為105～106cfu/mL。置20 ℃避光儲存。

2.2.3 存活菌數測定廠家提供的三批藥品均為口服制劑，按照《中國藥典》2020 年版口服制劑抑菌效力標準進行判斷［2］，5 種供試菌分別于接種后的14 d、28 d 測定其供試樣品中存活菌數，按照菌落計數法適用性試驗所確定的方法，測定供試品中所含的菌數是否滿足要求。計算l mL 供試品各試驗菌在14 d，28 d 各間隔時間的菌數減少值，并換算成1 g 值（見表2）。

表2 抑菌效力測試結果

2.2.4 口服制劑抑菌效力判斷標準根據《中國藥典》2020 年版四部制劑通則“1121 抑菌效力檢查法”的規定［2］，口服制劑藥品取樣時間間隔為14 d 和28 d。細菌數量換算成lg 值后，在14 d 時減少的lg值要不小于3；真菌數量換算成lg 值后，在14 d 減少的lg 值要不小于1。細菌和真菌在28 d 數量相對于14 d 來看，數量增加不超過0.5 lg 視為未增加。

三批藥品在第14 天，細菌菌數跟初始加入的菌數比，下降的lg 值均大于3，真菌菌數跟初始加入的真菌數比，下降的lg 值均大于1；在第28 天，三批藥品的細菌數和真菌數與第14 天相比，減少的lg值為0，無增加；根據上述抑菌效力判斷標準，該廠家提供的三批次藥品均通過抑菌效力挑戰試驗。

3 討論

抑菌劑也被稱為防腐劑，在制劑中添加抑菌劑的時候，不僅要考慮抑菌效果，還要同時考慮抑菌劑的毒性［7］。《中國藥典》2020 年版糖漿劑中規定添加苯甲酸的用量不得過0.3%（其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計）［2］，這個范圍很寬泛，本試驗結果雖然表明該廠提供的藥品制劑通過了抑菌效力測試，但對于抑菌劑添加量的確定還需要廠家進一步摸索試驗［8］。

另外，廠家提供的是糖漿劑，糖漿劑本身是含有高濃度的蔗糖水溶液，這類口服制劑還可選用魯氏酵母菌，該菌可耐受高糖高鹽高滲環境，如果該抑菌效力測定中加入魯氏酵母菌作為試驗菌株，將更加全面、科學［9］。

抑菌劑的添加是為了保證用藥安全，防止在使用期間藥品被微生物污染，但添加抑菌劑的量及抑菌劑的種類，都需要生產企業嚴格把關，不能只為了抑菌效力達標，而盲目添加［10-11］。另外，全面了解各類抑菌劑的特性及影響因素，合理科學地添加才能保證用藥安全。