HPLC 法測定婦康樂顆粒中延胡索乙素的含量

易徐航，張鈺祺，楊恢檢，熊毓，周璇，陳雅靜

萍鄉市食品藥品檢驗所，江西 萍鄉 337000

婦康樂顆粒為萍鄉市中醫院的醫院制劑，由延胡索、澤蘭、香附、夏枯草、當歸、白花蛇舌草、魚腥草等7 味中藥組成。具有清熱解毒，利濕止帶之功效，主治盆腔炎（附件炎）所致黃帶、下腹痛等。延胡索為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖，具有活血，行氣，止痛之功效。常用于胸脅、脘腹疼痛，經閉痛經，產后瘀阻，跌撲腫痛［1］，其主要藥效成分為延胡索乙素［2-6］。研究表明，延胡索乙素具有鎮痛、保護心肌等作用［6-10］。處方中延胡索作為其中君藥之一，其品質將直接影響到婦康樂顆粒制劑的臨床療效。因此，為更好地對婦康樂顆粒中延胡索進行內在質量的控制，本研究以延胡索乙素作為考察指標，采用HPLC 法建立了婦康樂顆粒中延胡索乙素的含量測定方法，以期為婦康樂顆粒的內在質量控制提供科學依據。

1 材料

1.1 試藥

對照品：延胡索乙素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-202020，含量以99.3%計）；試劑：甲醇、乙腈（HPLC 級，北京百靈威公司）；其他試劑均為AR 級；水為屈臣氏蒸餾水；婦康樂顆粒（規格10 g/袋）由萍鄉市中醫院提供。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，型號1200）；萬分之一天平（瑞士Mettler 公司，型號ME-204）；十萬分之一天平（德國Satorius 公司，型號CP225D）；酸度計（德國Satorius 公司，型號PB-10）；超聲儀（江蘇昆山舒美公司，型號KQ-500VDE）。

2 方法及結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品儲備液的制備精密稱取延胡索乙素對照品9.75 mg 置100 mL 量瓶中，加入甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含0.096 8 mg 的儲備溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取5 袋內容物置研缽中研細，稱取約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液25 mL，稱定重量，超聲處理（500 W，45 kHz）30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備取澤蘭100 g、香附150 g、夏枯草200 g、當歸150 g、白花蛇舌草300 g、魚腥草300 g 加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1 h，合并煎煮液，濾過，在60 ℃下濃縮煎液至相對密度約為1.15～1.18，加入乙醇使含醇量約為60%，放置48 h，上清液回收乙醇，得相對密度為1.13～1.17（60 ℃）的清膏，加入適量的輔料（糊精和蔗糖），制成陰性樣品顆粒，60 ℃以下干燥，制成1 000 g，按“2.1.2”項下方法操作，制成缺延胡索藥材的婦康樂顆粒陰性樣品溶液，依法測定，結果表明：陰性樣品的HPLC 圖譜中，未出現與對照品保留時間一致的色譜峰，見圖1。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC -C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.6%冰醋酸溶液（三乙胺調整pH值為6.0）為流動相A，乙腈為流動相B。梯度洗脫（0～20 min，57% A；20～22 min，57% A →20% A；22～25 min，20% A →57% A；25～35 min，57% A）。檢測流速為1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。結果顯示，對照品與其他組分的色譜峰分離度良好。對照品、供試品、陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.延胡索乙素對照品；B.供試品；C.陰性樣品

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察精密量取“2.1.1”對照品儲備液，加甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液逐級稀釋得系列標準溶液，含延胡索乙素分別為6.052，12.105，24.209，48.419，96.837 mg/L。按“2.2”項下色譜條件進樣，以進樣濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得線性方程：Y=17.961 2X+0.750 4，r=0.999 9。結果表明對照品進樣濃度在6.052～96.837 mg/L 范圍內呈良好線性關系。

2.3.2 精密度試驗精密吸取對照品溶液（24.209 mg/L）10 μL，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6 針，記錄對照品的峰面積，其RSD 為0.8%。結果表明精密度良好。

2.3.3 穩定性實驗取同一批次（批號20210412）的樣品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、12 h精密吸取10 μL 進樣，按“2.2”項下色譜條件，記錄峰面積，結果RSD 為0.8%。結果表明在室溫下婦康樂顆粒供試品溶液12 h 內穩定。

2.3.4 重復性試驗取同一批次（批號20210412）樣品6 份，按“2.1.2”項下方法制備重復性試驗供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算延胡索乙素的含量（mg/g）。結果RSD 為1.6%，表明該方法重現性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗取已知含量（0.060 2 mg/g）的婦康樂顆粒樣品，置研缽中研細，稱取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入適量對照儲備液，按“2.1.2”項下方法制備，按“2.2”項下色譜條件測定含量，測定加樣回收率，結果表明延胡索乙素的平均回收率為98.7%，RSD 為2.7%，結果見表1。

表1 回收率試驗

2.3.6 耐用性試驗取同一批次（批號20210412）樣品，按“2.1.2”項下方法制備，按“2.2”項下色譜條件，分別采用Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 種品牌的色譜柱進行測定，結果差異無統計學意義。

2.4 樣品測定

取不同批號婦康樂顆粒樣品，按“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試液。按“2.2”項下色譜條件進樣和分析，結果見表2。

表2 婦康樂顆粒樣品中延胡索含量測定結果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

采用DAD 檢測器對延胡索乙素對照品在210～400 nm 波長范圍內掃描，結果顯示最大吸收波長為280 nm，故選擇280 nm 作為檢測波長。在流動相的選擇中，由于婦康樂顆粒中含七味中藥，成分復雜，參考《中國藥典》2020 年版一部延胡索含量測定項下流動相0.1%磷酸（三乙胺調整pH 值為6.0）-甲醇（45∶55），結果延胡索乙素的分離度達不到要求。通過對甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸（三乙胺調整pH 值為6.0），0.6%冰醋酸溶液（三乙胺調整pH 值為6.0）-乙腈系統梯度洗脫進行比較，結果0.6%冰醋酸溶液（三乙胺調整pH 值為6.0）-乙腈梯度洗脫條件下分離效果最好，峰形最佳，故選擇0.6%冰醋酸溶液（三乙胺調整pH 值為6.0）-乙腈為流動相。

3.2 提取方法及時間的考察

提取條件采用超聲提取法分別考察了甲醇、50%甲醇、甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液作為提取溶劑［11-12］，結果表明甲醇-濃氨（20∶1）提取方式最佳。在此基礎上，分別考察了超聲和回流2 種提取方式，結果超聲與回流提取效率相似，故選用操作簡便的超聲提取方式。同時對甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液用量10 mL、25 mL、50 mL 以及超聲處理時間15 min、30 min、1 h 進行考察，最后確定采用甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液25 mL 超聲處理（500 W，45 kHz）30 min 為宜。

3.3 小結

本研究建立了婦康樂顆粒中延胡索乙素的含量測定方法，經方法學驗證，該方法準確、快速，操作簡便，專屬性強，重現性好。從5 批婦康樂顆粒樣品中延胡索的含量測定結果來看，延胡索乙素的含量為0.055 1 mg/g～0.119 0 mg/g，可用于婦康樂顆粒的質量評價。