杞菊地黃口服液質量控制研究

南榮華，張娜，康小鳳，賈萌,3，黃艷

1.陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065；2.陜西省醫療器械質量檢驗院，陜西 西咸新區 712046；3.國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西 西安 710065

杞菊地黃口服液由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮等加工而成，滋腎養肝，用于肝腎陰虧，暈耳鳴，明畏光，迎風流淚，視物昏花［1］。熟地黃富含地黃素、梓醇等多種微量元素［2］，具有抗氧化，增強免疫力的藥理作用［3-4］。山茱萸有補益肝腎，收澀固脫功效，其化學成分具有神經保護、抗氧化等作用［5］。牡丹皮具有抗氧化，抗菌，抗炎作用，其多糖對糖尿病有治療作用［6-10］。標準初收錄于中華人民共和國衛生部藥品標準《中藥成方制劑》第十一冊［11］，2020 版《中國藥典》中列入馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚含量測定，文獻資料對其余成分的含量研究報道較少。此次研究，同步測定6個指標成分含量，為該制劑質量控制提供技術參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Sartorius BP211D 電子分析天平（d=0.01,0.1 mg，賽多利斯公司）；LC-2040C 3D 高效液相色譜儀（島津，二極管陣列檢測器，Empower 色譜工作軟件）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器；UV-2550 紫外分光光度計；UPH-11-10T 超純水機（優普公司）。

1.2 試藥

沒食子酸（批號：110831-201204，純度89.9%）；綠原酸（批號：110753-201716，純度99.3%）；莫諾苷（批號：111998-201703，純度97.4%）；馬錢苷（批號：111640-201707，純度99.2%）；木犀草苷（批號：111720-201609，純度94.9%）；丹皮酚（批號：110708-201407，純度99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院。杞菊地黃口服液樣品為國家評價性抽驗所得，陰性對照為自購合格藥材按處方工藝制得。乙腈為色譜純（德國默克），水為超純水；其余試劑為分析純（國藥化學試劑公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：（安捷倫C18 柱4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A（乙腈）,B（0.1%甲酸溶液）梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：240 nm（沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草甘、丹皮酚），328 nm（綠原酸）；進樣量：10～25 μL；理論塔板數以馬錢苷峰計算應不低于5 000，梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

對照品溶液：取沒食子酸、綠原酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚6 種對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度各為0.056 57、0.023 34、0.109 17、0.076 07、0.020 78、0.190 21 mg/mL 的對照品溶液。

供試品溶液：精密量取供試品5 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，振搖后超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）15 min，放至室溫，用50%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，即得。

2.3 專屬性試驗

吸取“2.2”項下四種溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。空白溶液無干擾，專屬性好，各組分分離完全，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.混合對照品（240 nm）；B.混合對照品（328 nm）；C.供試品（240 nm）；D.供試品（328 nm）；E.空白溶液（240 nm）；F.空白溶液（328 nm）

2.4 線性關系考察

精密稱取馬錢苷對照品7.18 mg、莫諾苷對照品7.75 mg、丹皮酚7.51 mg 置25 mL 量瓶中，再精密加入綠原酸對照品溶液（濃度0.233 4 mg/mL）、木犀草苷對照品溶液（濃度0.207 8 mg/mL）、沒食子酸對照品溶液（0.565 7 mg/mL）各5 mL，加入50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，作為線性濃度①。分別精密吸取線性濃度①溶液5.0、3.0、2.0、1.0 mL 置10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性濃度②、③、④、⑤。再取線性濃度⑤溶液，精密吸取5.0 mL 置10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，作為線性濃度⑥。分別精密吸取上述六種溶液各10 μL，按擬定方法進行測定，以對照品的進樣量（μg）為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。回歸方程分別為：沒食子酸Y=888 642.35X-1 163.13，r=1.000 0；綠原酸Y=2 968 925.52X-8 028.39，r=1.000 0；莫諾 苷Y=1 649 043.91X-241.06，r=1.000 0；馬 錢苷Y=1 477 886.09X-5 639.72，r=1.000 0；木犀草苷Y=1 855 045.43X-1 177.50，r=1.000 0；丹皮酚Y=1 250 925.49X+46 760.59，r=1.000 0。結果表明，沒食子酸進樣量0.056 6～1.131 4 μg、綠原酸進樣量0.023 3～0.466 8 μg、莫諾苷進樣量0.151 0～3.019 4 μg、馬錢苷進樣量0.142 5～2.849 0 μg、木犀草苷進樣量0.020 8～0.415 6 μg、丹皮酚進樣量0.150 0～3.001 0 μg，線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下對照品溶液10 μL，重復進樣6 次，按擬定色譜條件測定峰面積。沒食子酸、綠原酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚峰面積的RSD 值依次為0.17%、0.11%、0.13%、0.11%、0.17%、0.06%，表明精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液10 μL，按擬定色譜條件進樣6 次，每次間隔5.5 h，結果表明穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取同批號口服液，照擬定方法平行制備供試品溶液6 份，測定峰面積，計算得沒食子酸、綠原酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草苷和丹皮酚含量的RSD 值分別為0.30%、0.72%、0.42%、0.24%、1.31%、0.65%。

2.8 加樣回收試驗

精密吸取已知含量的杞菊地黃口服液（沒食子酸0.156 6 mg/mL，綠原酸0.010 85 mg/mL，莫諾苷0.364 8 mg/mL，馬錢苷0.176 6 mg/mL，木犀草苷0.013 33 mg/mL，丹皮酚0.085 16 mg/mL）6 份，每份2.5 mL，精密加水2.5 mL，精密加入對照品混合溶液（沒食子酸0.023 752 mg/mL，綠原酸0.002 343 mg/mL，莫諾苷0.058 869 mg/mL，馬錢苷0.025 038 mg/mL，木犀草苷0.002 05 mg/mL，丹皮酚0.012 268 mg/mL）20 mL，同法制備供試品溶液，按擬定色譜條件測定，計算平均回收率，結果見表2（n=6）。

表2 加樣回收收率結果

2.9 耐用性試驗

更換安捷倫1260 Ⅱ型高效液相色譜儀，資生堂SPOLAR C18 色譜柱，樣品待測定峰均分離完全，說明耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

以擬定方法測定從全國23 個省、自治區、直轄市的不同的抽樣地點抽取的7 家不同生產企業樣品65 批。結果見表3。

表3 樣品含量測定表（mg/mL）

3 討論

3.1 提取條件

試驗建立過程中，參考各方文獻，在考察供試品的制備方法時，考慮到六種成分的溶解特性，考察水、50%甲醇、甲醇為溶劑，結果顯示，以50%甲醇為溶劑［12］，測定各成分的含量最高；另外考察提取溶劑體積20 mL、50 mL，結果顯示20 mL 即可提取完全；考察提取方法及時間，結果超聲提取和加熱回流提取率差異不大，選擇超聲提取15 min 便于操作。

3.2 色譜條件

試驗考察有機相（甲醇、乙腈），水相（水、0.1%甲酸溶液），梯度洗脫，結果表明，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相梯度洗脫，基線平穩，分離度較好［13］；考察柱溫（25、30、35、40 ℃），為40 ℃時，供試品色譜中目標峰與相鄰峰間分離度最佳。

4 結論

此次建立的方法，可以同步測定杞菊地黃口服液中沒食子酸、綠原酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚六種成分含量，專屬性較強，一定程度上同時控制制劑中酒萸肉、牡丹皮、菊花3 味藥材的質量，體現不同生產企業、不同批次之間的差異和穩定性［14-15］,評價市售杞菊地黃口服液質量。以性質穩定、特征性強的馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚為指標成分，為企業質控和藥品科學監管提供新的技術參考。