氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定注射級(jí)聚山梨酯80 中乙二醇、二甘醇、三甘醇?xì)埩袅?/h1>
2022-09-02 13:52:18謝華萍鄧雙炳魏勇翔鐘仁清唐會(huì)英張繼輝
藥品評(píng)價(jià) 2022年11期 關(guān)鍵詞：方法
謝華萍，鄧雙炳,2，魏勇翔，鐘仁清，唐會(huì)英，張繼輝
1.江西青峰藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.江西省藥品檢查員中心第三檢查所，江西 贛州 341000
現(xiàn)今，隨著中藥注射劑不斷地發(fā)展，在臨床上廣泛應(yīng)用，關(guān)于其不良反應(yīng)的研究也逐漸增多［1-3］，輔料的質(zhì)量安全也逐漸成為大家關(guān)注的重點(diǎn)，有研究表明［4］，輔料在藥品制劑的質(zhì)量、安全性和有效性方面有重要的影響，也越來(lái)越多證據(jù)表明，注射劑中輔料造成的不良反應(yīng)的是很多注射劑不良反應(yīng)的根源甚至可以引起群體性藥害事件［5］，如依托泊苷注射液、多西紫杉醇注射液和魚腥草注射液等事件［6-7］，均表明聚山梨酯80 是引起不良反應(yīng)的主要原因之一。因此聚山梨酯80 的質(zhì)量安全性研究應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)，殘留溶劑是評(píng)價(jià)質(zhì)量安全性的重要指標(biāo)，現(xiàn)今注射劑藥用輔料殘留溶劑研究的文獻(xiàn)［8］非常少。乙二醇、二甘醇及二甘醇，是聚山梨酯80 合成過(guò)程中使用了環(huán)氧乙烷而形成的副產(chǎn)物，在終產(chǎn)品中很有可能存在，可能具有一定的毒性［9］，存在較大風(fēng)險(xiǎn)。《中國(guó)藥典》2020 年版［10］方法對(duì)三種溶劑進(jìn)行了研究，但是該方法柱溫升溫程序較長(zhǎng)，故對(duì)方法進(jìn)行探索。本研究參考《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則［10］，建立氣相色譜（GC）法同時(shí)測(cè)定注射用輔料聚山梨酯80 中的乙二醇、二甘醇、三甘醇。
1 儀器和試藥
1.1 儀器
7890B 氣相色譜儀（安捷倫公司）、XS205 電子天平（梅特勒-托利多有限公司）。
1.2 試藥
乙二醇（批號(hào)：140812-001，廣東光華科技股份有限公司），二甘醇（批號(hào)：151208-001），三甘醇（批號(hào)：151208-001）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,3-丁二醇（批號(hào)：150602-001，上海麥克林生化科技有限公司），無(wú)水乙醇（批號(hào)：200409-005，美國(guó)天地公司）；聚山梨酯80（批號(hào)：180301、180302、190502，湖北葛店人福藥用輔料有限責(zé)任公司）。
1.3 溶液的制備
空白溶液：無(wú)水乙醇。內(nèi)標(biāo)溶液：取適量1,3-丁二醇，精密稱定，用無(wú)水乙醇制成每1 mL 含1,3-丁二醇4 mg 的溶液。供試品溶液：精密稱定樣品聚山梨酯80 約4 g，加入100 mL 量瓶中，再精密移取內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。對(duì)照品貯備溶液：分別取適量二甘醇、三甘醇和乙二醇，精密稱定，用無(wú)水乙醇稀釋制成每1 mL 含二甘醇、三甘醇和乙二醇各4 mg 的溶液。對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品貯備溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各1 mL，置于100 mL 量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。靈敏度試驗(yàn)溶液：取對(duì)照品溶液1 mL，精密量取，置于10 mL 量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。
1.4 色譜參數(shù)
色譜柱：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷（DB-624，60 m×0.32 mm×1.8 μm）為固定液的毛細(xì)管柱。柱溫：程序升溫，具體參數(shù)見(jiàn)表1；載氣（N2）流速5 mL/min，分流比為2∶1，進(jìn)樣口溫度為230 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃。
表1 升溫程序
1.5 測(cè)定法
分別取空白溶液、靈敏度溶液、內(nèi)標(biāo)溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。
2 方法與結(jié)果
2.1 專屬性
分別取空白溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液按照擬定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇、三甘醇保留時(shí)間分別為6.382 min、11.057 min、12.871 min、18.111 min，各組分的分離度大于2.0，且空白對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，專屬性良好。見(jiàn)圖1。
圖1 色譜圖：A.空白溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液
2.2 檢測(cè)限與定量限
照“1.3”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，再用空白溶液稀釋成不同濃度，以3 倍基線噪音計(jì)算，可以得到乙二醇、二甘醇、三甘醇的檢測(cè)限；以10 倍基線噪音計(jì)算，可以得到乙二醇、二甘醇、三甘醇的定量限，結(jié)果表明，此方法的檢測(cè)靈敏度及定量限均能達(dá)到報(bào)告限度的要求。見(jiàn)表2。
表2 3種溶劑的檢測(cè)限及定量限、線性關(guān)系
2.3 線性與范圍
取“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，用無(wú)水乙醇制成每1 mL 溶液中含乙二醇和二甘醇、三甘醇定量限濃度及8 μg、20 μg、40 μg、48 μg、60 μg 濃度的線性溶液，進(jìn)樣測(cè)定。
繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)為各溶劑的峰面積，橫坐標(biāo)為不同濃度。結(jié)果表明，各溶劑相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999 0，能滿足線性要求。見(jiàn)表2。
2.4 精密度
按“1.3”項(xiàng)下制備空白溶液及對(duì)照品溶液。加標(biāo)供試品溶液：精密稱定聚山梨酯80 樣品6 份，約4 g，置于100 mL 量瓶中，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液及對(duì)照品貯備液各1 mL，加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。按照擬定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各溶劑測(cè)定值RSD（n=6），均不超過(guò)10%，方法的重復(fù)性符合驗(yàn)證要求；由不同人員、不同日期，同重復(fù)性試驗(yàn)的方法進(jìn)行中間精密度測(cè)定，將結(jié)果與重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果計(jì)算各溶劑測(cè)定值的RSD（n=12），均不超過(guò)10%，方法的中間精密度符合驗(yàn)證要求。表明方法的精密度良好。見(jiàn)表2。
2.5 準(zhǔn)確度
按“1.3”項(xiàng)下制備空白溶液及對(duì)照品溶液。加標(biāo)供試品溶液：精密稱定聚山梨酯80 樣品9 份，約4 g，置于100 mL 量瓶中，精密移取1 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，再精密移取0.8 mL、1 mL、1.2 mL 對(duì)照品貯備液（由于目標(biāo)成分為未檢出或者含量較低，故統(tǒng)一按照限度濃度進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)濃度分別為限度濃度的80%、100%、120%），每個(gè)濃度水平各三份，再加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。分別按照擬定方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算各溶劑的回收率和RSD。各溶劑回收率范圍為80%～120%，且RSD 小于10%，表明準(zhǔn)確度良好。分別見(jiàn)表3～5。
表3 乙二醇回收率試驗(yàn)結(jié)果
表4 二甘醇回收率試驗(yàn)結(jié)果
表5 三甘醇回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.6 耐用性
2.6.1 溶液穩(wěn)定性在自然條件下，取“2.4”項(xiàng)下加標(biāo)供試品溶液，分別于0、4、8、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算結(jié)果為RSD 為0.2%～8.2%，說(shuō)明自然條件下的供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。
2.6.2 色譜參數(shù)變化取“1.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和“2.4”項(xiàng)下加標(biāo)供試品溶液，分別按正常參數(shù)和調(diào)整流速、柱溫等參數(shù)條件下進(jìn)樣，以各溶劑含量為測(cè)定值。計(jì)算參數(shù)變化后的測(cè)定值和正常參數(shù)測(cè)定值的RSD。結(jié)果顯示，流速的變化范圍為4.5 mL～5.5 mL，各溶劑的RSD 不大于3.5%；柱溫的變化范圍為55 ℃～65 ℃，各溶劑的RSD 不大于2.8%。均不大于10%，方法耐用性良好。
2.7 樣品結(jié)果
取3 批聚山梨酯80 樣品按擬定方法測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 樣品測(cè)試結(jié)果表（%）
3 討論
本研究主要建立了注射級(jí)藥用輔料聚山梨酯80中乙二醇、二甘醇、三甘醇?xì)埩羧軇z測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便。本研究對(duì)中國(guó)藥典方法進(jìn)行優(yōu)化，縮短了檢測(cè)分析時(shí)間，節(jié)約時(shí)間及成本，可為聚山梨酯80 的殘留溶劑控制提供一種替代方案；也為其他注射級(jí)藥用輔料的殘留溶劑分析方法提供參考，具有一定的指導(dǎo)意義。
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謝華萍，鄧雙炳,2，魏勇翔，鐘仁清，唐會(huì)英，張繼輝
1.江西青峰藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.江西省藥品檢查員中心第三檢查所，江西 贛州 341000
現(xiàn)今，隨著中藥注射劑不斷地發(fā)展，在臨床上廣泛應(yīng)用，關(guān)于其不良反應(yīng)的研究也逐漸增多［1-3］，輔料的質(zhì)量安全也逐漸成為大家關(guān)注的重點(diǎn)，有研究表明［4］，輔料在藥品制劑的質(zhì)量、安全性和有效性方面有重要的影響，也越來(lái)越多證據(jù)表明，注射劑中輔料造成的不良反應(yīng)的是很多注射劑不良反應(yīng)的根源甚至可以引起群體性藥害事件［5］，如依托泊苷注射液、多西紫杉醇注射液和魚腥草注射液等事件［6-7］，均表明聚山梨酯80 是引起不良反應(yīng)的主要原因之一。因此聚山梨酯80 的質(zhì)量安全性研究應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)，殘留溶劑是評(píng)價(jià)質(zhì)量安全性的重要指標(biāo)，現(xiàn)今注射劑藥用輔料殘留溶劑研究的文獻(xiàn)［8］非常少。乙二醇、二甘醇及二甘醇，是聚山梨酯80 合成過(guò)程中使用了環(huán)氧乙烷而形成的副產(chǎn)物，在終產(chǎn)品中很有可能存在，可能具有一定的毒性［9］，存在較大風(fēng)險(xiǎn)。《中國(guó)藥典》2020 年版［10］方法對(duì)三種溶劑進(jìn)行了研究，但是該方法柱溫升溫程序較長(zhǎng)，故對(duì)方法進(jìn)行探索。本研究參考《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則［10］，建立氣相色譜（GC）法同時(shí)測(cè)定注射用輔料聚山梨酯80 中的乙二醇、二甘醇、三甘醇。
1 儀器和試藥
1.1 儀器
7890B 氣相色譜儀（安捷倫公司）、XS205 電子天平（梅特勒-托利多有限公司）。
1.2 試藥
乙二醇（批號(hào)：140812-001，廣東光華科技股份有限公司），二甘醇（批號(hào)：151208-001），三甘醇（批號(hào)：151208-001）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,3-丁二醇（批號(hào)：150602-001，上海麥克林生化科技有限公司），無(wú)水乙醇（批號(hào)：200409-005，美國(guó)天地公司）；聚山梨酯80（批號(hào)：180301、180302、190502，湖北葛店人福藥用輔料有限責(zé)任公司）。
1.3 溶液的制備
空白溶液：無(wú)水乙醇。內(nèi)標(biāo)溶液：取適量1,3-丁二醇，精密稱定，用無(wú)水乙醇制成每1 mL 含1,3-丁二醇4 mg 的溶液。供試品溶液：精密稱定樣品聚山梨酯80 約4 g，加入100 mL 量瓶中，再精密移取內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。對(duì)照品貯備溶液：分別取適量二甘醇、三甘醇和乙二醇，精密稱定，用無(wú)水乙醇稀釋制成每1 mL 含二甘醇、三甘醇和乙二醇各4 mg 的溶液。對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品貯備溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各1 mL，置于100 mL 量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。靈敏度試驗(yàn)溶液：取對(duì)照品溶液1 mL，精密量取，置于10 mL 量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。
1.4 色譜參數(shù)
色譜柱：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷（DB-624，60 m×0.32 mm×1.8 μm）為固定液的毛細(xì)管柱。柱溫：程序升溫，具體參數(shù)見(jiàn)表1；載氣（N2）流速5 mL/min，分流比為2∶1，進(jìn)樣口溫度為230 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃。
表1 升溫程序
1.5 測(cè)定法
分別取空白溶液、靈敏度溶液、內(nèi)標(biāo)溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。
2 方法與結(jié)果
2.1 專屬性
分別取空白溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液按照擬定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇、三甘醇保留時(shí)間分別為6.382 min、11.057 min、12.871 min、18.111 min，各組分的分離度大于2.0，且空白對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，專屬性良好。見(jiàn)圖1。
圖1 色譜圖：A.空白溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液
2.2 檢測(cè)限與定量限
照“1.3”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，再用空白溶液稀釋成不同濃度，以3 倍基線噪音計(jì)算，可以得到乙二醇、二甘醇、三甘醇的檢測(cè)限；以10 倍基線噪音計(jì)算，可以得到乙二醇、二甘醇、三甘醇的定量限，結(jié)果表明，此方法的檢測(cè)靈敏度及定量限均能達(dá)到報(bào)告限度的要求。見(jiàn)表2。
表2 3種溶劑的檢測(cè)限及定量限、線性關(guān)系
2.3 線性與范圍
取“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，用無(wú)水乙醇制成每1 mL 溶液中含乙二醇和二甘醇、三甘醇定量限濃度及8 μg、20 μg、40 μg、48 μg、60 μg 濃度的線性溶液，進(jìn)樣測(cè)定。
繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)為各溶劑的峰面積，橫坐標(biāo)為不同濃度。結(jié)果表明，各溶劑相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999 0，能滿足線性要求。見(jiàn)表2。
2.4 精密度
按“1.3”項(xiàng)下制備空白溶液及對(duì)照品溶液。加標(biāo)供試品溶液：精密稱定聚山梨酯80 樣品6 份，約4 g，置于100 mL 量瓶中，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液及對(duì)照品貯備液各1 mL，加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。按照擬定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各溶劑測(cè)定值RSD（n=6），均不超過(guò)10%，方法的重復(fù)性符合驗(yàn)證要求；由不同人員、不同日期，同重復(fù)性試驗(yàn)的方法進(jìn)行中間精密度測(cè)定，將結(jié)果與重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果計(jì)算各溶劑測(cè)定值的RSD（n=12），均不超過(guò)10%，方法的中間精密度符合驗(yàn)證要求。表明方法的精密度良好。見(jiàn)表2。
2.5 準(zhǔn)確度
按“1.3”項(xiàng)下制備空白溶液及對(duì)照品溶液。加標(biāo)供試品溶液：精密稱定聚山梨酯80 樣品9 份，約4 g，置于100 mL 量瓶中，精密移取1 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，再精密移取0.8 mL、1 mL、1.2 mL 對(duì)照品貯備液（由于目標(biāo)成分為未檢出或者含量較低，故統(tǒng)一按照限度濃度進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)濃度分別為限度濃度的80%、100%、120%），每個(gè)濃度水平各三份，再加無(wú)水乙醇至刻度，混勻。分別按照擬定方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算各溶劑的回收率和RSD。各溶劑回收率范圍為80%～120%，且RSD 小于10%，表明準(zhǔn)確度良好。分別見(jiàn)表3～5。
表3 乙二醇回收率試驗(yàn)結(jié)果
表4 二甘醇回收率試驗(yàn)結(jié)果
表5 三甘醇回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.6 耐用性
2.6.1 溶液穩(wěn)定性在自然條件下，取“2.4”項(xiàng)下加標(biāo)供試品溶液，分別于0、4、8、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算結(jié)果為RSD 為0.2%～8.2%，說(shuō)明自然條件下的供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。
2.6.2 色譜參數(shù)變化取“1.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和“2.4”項(xiàng)下加標(biāo)供試品溶液，分別按正常參數(shù)和調(diào)整流速、柱溫等參數(shù)條件下進(jìn)樣，以各溶劑含量為測(cè)定值。計(jì)算參數(shù)變化后的測(cè)定值和正常參數(shù)測(cè)定值的RSD。結(jié)果顯示，流速的變化范圍為4.5 mL～5.5 mL，各溶劑的RSD 不大于3.5%；柱溫的變化范圍為55 ℃～65 ℃，各溶劑的RSD 不大于2.8%。均不大于10%，方法耐用性良好。
2.7 樣品結(jié)果
取3 批聚山梨酯80 樣品按擬定方法測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 樣品測(cè)試結(jié)果表（%）
3 討論
本研究主要建立了注射級(jí)藥用輔料聚山梨酯80中乙二醇、二甘醇、三甘醇?xì)埩羧軇z測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便。本研究對(duì)中國(guó)藥典方法進(jìn)行優(yōu)化，縮短了檢測(cè)分析時(shí)間，節(jié)約時(shí)間及成本，可為聚山梨酯80 的殘留溶劑控制提供一種替代方案；也為其他注射級(jí)藥用輔料的殘留溶劑分析方法提供參考，具有一定的指導(dǎo)意義。
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