臭氧脅迫對大豆抗氧化代謝與生殖生長的影響

李程程，張子蕤，宋曉萱，孔娟娟，韓陽，阮亞男

遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036

近地層臭氧（O3）是一種分布較廣且對生物有害的氣體污染物，它不僅直接威脅著人類和動物的健康，對植物生長發育也有影響（Lefohn et al.，2018；Grulke et al.，2020；Kuerban et al.，2020）。由于 O3污染的不斷加劇及對農林植物的損害強度的增加，O3問題已經受到越來越多的關注（Edenhofer et al.，2014；Wang et al.，2016；Emberson，2020）。

近地層 O3大量來自人為排放的氮氧化物（NOx）、植物可揮發性有機化合物（VOCs，volatile organic compounds）、一氧化碳（CO）和甲烷（CH4）等前體物在強光下的光化學反應產物，以及少量來自平流層大氣的O3傳輸（馮兆忠，2020）。中國國家環境監測網絡 2013—2017年的數據表明，中國近地層O3年均摩爾分數以3 nmol·mol-1的速度升高（Wang et al.，2019）。全國近地層O3摩爾分數每日8 h滑動平均最大值（MDA8）的年平均值達到(41.2±6.3) nmol·mol-1，長江三角洲等地 MDA8 最大值年平均值高達60—70 nmol·mol-1（Lu et al.，2018；馮兆忠等，2020）。由于O3形成的前體物質排放濃度不穩定，而且無規律性，以及光輻射的晝夜變化、季節性變化及陰雨天氣的影響，導致近地層 O3濃度波動較大。O3污染具有日周期變化的特點，夜間O3濃度僅為白天的60%，在天氣晴朗的夏季表現尤為突出（Bullbovas et al.，2014；易睿等，2015；阮亞男等，2017）。

O3是具有極強氧化毒性的二次污染物，對植物葉片的可見傷害是最直觀的表現。研究發現，200 nmol·mol-1O3熏蒸 10 d即可造成銀杏（Ginkgo biloba）葉片邊緣卷曲和壞死現象（易睿等，2015）。高濃度 O3通過植物氣孔進入到葉肉細胞，溶于細胞壁的結合水中，直接參與或形成活性氧（ROS）間接與細胞壁、細胞質膜的生物大分子發生反應，破壞細胞結構、影響植物正常代謝，對植物形態、生理生化、基因表達、蛋白表達等均有不同程度的影響（Zhao et al.，2005；Bullbovas et al.，2014；阮亞男等，2017）。O3誘導產生的大量ROS可誘導植物體內抗氧化系統啟動防御機制，抗壞血酸等抗氧化物在細胞質外體清除ROS，過氧化氫酶、抗壞血酸-谷胱甘肽循環等重要抗氧化物質在共質體內清除余下的 ROS（馮兆忠等，2020）。但植物依靠自身的抗氧化代謝抵御近地層 O3濃度升高是有一定限度的。短期升高的O3濃度（100 nmol·mol-1）下大豆（Glycinemax）葉片影響三羧酸（TCA）循環、細胞壁組成和氨基酸的代謝物，促進氣孔關閉的茉莉酸相關代謝物被誘導，比自然濃度處理升高了125倍（Zhang et al.，2021）。而低濃度O3處理卻可以增加植物葉面積和生物量，60 nmol·mol-1熏蒸豇豆（Vignaunguiculata）幼苗使豇豆葉面積增加71.2%、生物量也顯著增加（Malaiyandi et al.，2014）。O3脅迫使敏感型大豆的葉面積降低，而耐受型大豆表現出相反的結果（Britz et al.，2001）。因此，不同的O3濃度通過誘導特定的生化和分子反應，可以對植物產生不同程度的影響（Li et al.，2021)。

O3濃度迅速變化的這種特性迫使植物經常經歷高濃度O3脅迫之后的濃度急劇下降，因此植物在受到O3脅迫后必須快速響應。因此，在O3污染加劇且濃度迅速變化的條件下，研究在不同濃度O3處理后，O3濃度恢復時作物氧化代謝變化，不僅有助于探究作物在恢復期對于O3濃度變化的響應機制，而且有助于確定明晰大豆生產中短期O3脅迫后的可修復濃度（Short et al.，2012；Changey et al.，2018）。大豆是世界范圍內廣泛種植的油料作物，其整個生長過程包括6個生育時期，分別為種子萌發期、幼苗期、分枝期、開花期、結莢鼓粒期和成熟期。大多數大豆品種具有臭氧的高敏感性（Osborne et al.，2016）。本實驗采用不同濃度臭氧熏蒸處理，9 d后停止臭氧通入，使大豆幼苗在自然環境下自我修復，通過測定熏蒸處理后恢復時期植株的生長、抗氧化酶活性、非酶抗氧化物質水平及抗逆基因的差異表現，擬解決以下問題：（1）短時間的高濃度及低濃度O3熏蒸是否會引起大豆體內ROS爆發，而誘導特定的生化及分子響應，最終導致生殖生長發生變化？（2）大豆應對短期高濃度與低濃度O3熏蒸后，恢復期的抗氧化機制是否存在差異，是否存在誘導抗性？

1 材料與方法

1.1 試驗區概況與實驗材料

試驗區位于中國科學院沈陽樹木園（41°46′N，123°26′E），屬北溫帶受季風影響的半濕潤大陸性氣候，四季分明，雨熱同期，年平均溫度6.2—9.7 ℃，降雨量755.4 mm。樹木園占地5 hm2，栽培大量東北地區木本植物，森林覆蓋率達57.3%，屬城市近自然林（阮亞男等，2008）。

供試大豆品種為遼豆 23號，由遼寧省農業科學院作物研究所提供，2017年5月28日播種。采用內徑40 cm，高30 cm的聚乙烯塑料桶進行盆栽。每盆裝風干土 15.0 kg，施營養素 N：1 g·kg-1；P2O5：0.6 g·kg-1；K2O：0.8 g·kg-1。形式分別為：尿素（H2NCONH2）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鉀（KCl）。出苗3 d后間苗至每盆4株大豆幼苗，6月30日將植株移入開頂式氣室進行緩苗。大豆種植期間的水分、肥料均勻一致，無病蟲害及雜草等限制因素。

1.2 試驗設計

采用開頂式氣室（Open-Top Chambers，OTCs）模擬熏蒸方法，設備為9個結構完全相同的OTCs（橫截面為正八邊形，直徑4 m，高3 m）及配套的通氣和監測設備，主要包括臭氧發生設備（XH-2000，廣州鑫弘智能環保設備有限公司，中國）、固定式氣體檢測儀（S-900，Aeroqual Inc.，新西蘭）、臭氧濃度自動控制器（Campbell Scientific Inc.，美國）實時監測開頂箱內臭氧濃度，及時調整臭氧濃度，保證實驗的準確性。

O3熏蒸試驗共設3個處理，O3摩爾分數分別為(40.16±8.22) nmol·mol-1（CK，自然環境臭氧摩爾分數）、80 nmol·mol-1、200 nmol·mol-1，每個處理隨機選擇3個OTCs，氣室內均放置9盆大豆植株。處理時間為7月3—12日，每天熏蒸O38 h（09:00—17:00），共熏蒸72 h。熏蒸結束后將植株置于自然臭氧濃度中，進入恢復實驗。

1.3 數量性狀與生理指標的測定方法

1.3.1 形態指標的測定方法

于大豆完熟期每個處理隨機選取3株，對大豆植株進行株高和葉面積測定。葉面積采用剪紙法，測定其第一完全展開葉葉面積。于完熟期在每個處理內隨機選取3株進行套透明紗網袋處理，大豆收獲后取地上及地下構件并進行分解，地上構件包括莖、葉、莢3部分，地下構件為根，于75 ℃烘干至恒重并獲得生物量。對所有大豆植株，測定單株結莢數和籽粒數，待籽粒自然風干后，測定單株籽粒生物量。

1.3.2 生理指標的測定方法

大豆分枝期進行生理指標的測定，取樣時間為停止急性熏蒸后的第0、1、2、4、8、24、48、72小時，即不同的恢復時間。所取葉片均為完全展開葉，用錫紙包裹放入液氮內，隨后保存至-80 ℃備用。帶回實驗室后對樣品進行生理指標的測定：參照鹽酸羥胺法（Ke et al.，2002）測定O2·-產生速率；硫酸鈦法（Mukherjee et al.，1985）測定H2O2含量；金屬離子比色法（Pellegrino et al.，2013）測定AsA及脫氫抗壞血酸（DHA）含量；GR-DTNB（谷胱甘肽還原酶-5, 5′-二硫代-2-硝基苯甲酸）循環法（Griffith，1980）測定GSH含量；氮藍四唑（NBT）還原法（Giannopolitis et al.，1977）測定SOD活性；紫外吸收法（Pryor，1995）測定CAT活性；Nakano& Asads方法（Nakano et al.，1981）測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）及谷胱甘肽還原酶（GR）活性；硫代巴比妥酸（TBA）法（Buege et al.，1978）測定丙二醛（MDA）含量。

1.4 抗逆基因mRNA轉錄水平的測定方法

TRIZOL法提取葉片總RNA，利用反轉錄試劑盒（HiFiScript cDNA Synthesis Kit，CW2569M）進行反轉錄，在NCBI檢索序列信息，用Primer Premier 5.0設計引物，利用合成的引物對各基因進行實時熒光定量 PCR（Quantitative real-time PCR，qRTPCR）擴增。以Actin3基因作為內參，利用 2-ΔΔCt方法（Livak et al.，2001）進行計算，得出大豆中SOD基因家族（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD）、CAT基因家族（CAT1、CAT2、CAT3、CAT4、CAT5）、APX、GR、AO、Aatin3基因的相對表達量。

1.5 數據處理

應用Microsoft Excel 2007與SPSS 19.0軟件對大豆完熟期的主要數量性狀及分枝期 O2·-產生速率、H2O2含量、丙二醛（MDA）含量、抗壞血酸（AsA）含量、谷胱甘肽（GSH）含量、抗氧化酶活性（APX、DHAR、MDAR和GR），及SOD基因家族、CAT基因家族、APX基因、GR基因相對表達量的影響進行方差分析，采用t檢驗（P＜0.05）比較各指標處理間差異的顯著性；采用重復測量方差分析恢復時間與熏蒸濃度對大豆以上各項生理指標的影響。應用Sigma Plot 12.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 形態指標的比較

經方差分析和多重比較，大豆表型主要形態性狀對不同濃度臭氧處理的響應存在一定的差異（表1）。其中，在生長性狀上，相同葉序的葉面積和株高在低濃度（80 nmol·mol-1）處理下與對照值相近，高濃度（200 nmol·mol-1）處理下則顯著低于對照（P＜0.05）；在物質生產和分配上，地上生物量在低濃度處理下與對照值沒有顯著差異，高濃度處理下則顯著低于對照，地下生物量則兩種處理均顯著低于對照，表明兩種處理對根系生長均產生了不利影響；在結實性狀上，單株豆莢數和單株種子數低濃度處理下均顯著高于對照，而高濃度處理與對照無顯著差異，表明兩種濃度O3處理對結實性狀均未產生不利影響；在種子大小性狀上，單株種子重在低濃度處理下與對照值相近，高濃度處理下則顯著低于對照。但兩種濃度O3處理的大豆種子百粒重都顯著低于對照，表明兩種處理的種子均變小，即不同濃度的O3處理可能對種子質量均產生了不利影響。

表1 不同濃度臭氧處理下大豆主要數量性狀的多重比較Table 1 Multiple comparison of main quantitative traits of soybean with different ozone concentrations

2.2 葉片生理活性物質的變化

2.2.1 活性氧

經方差分析和多重比較，O2·-產生速率在低濃度（80 nmol·mol-1）處理下與對照值無顯著差異，之后緩慢波動，72 h后速率降低12.7%（P＜0.01）；H2O2含量在低濃度處理下與對照值無顯著差異。表明低濃度處理并未對大豆產生不利影響。大豆葉片O2·-產生速率值和 H2O2含量在高濃度（200 nmol·mol-1）處理下顯著升高（P＜0.01），1 h 后達到最高值，之后逐漸下降，72 h時與對照值接近（圖1a、b）。臭氧濃度、恢復時間以及兩者的交互處理對分枝期大豆的 O2·-產生速率（P＜0.01）、H2O2含量（P＜0.01）有顯著影響。

圖1 不同濃度臭氧處理結束后對大豆葉片O2·-產生速率、H2O2含量的影響Figure 1 Effects of elevated ozone pretreatment to O2·-production rate, H2O2 content in soybean leaves

2.2.2 抗氧化酶

經O3處理的大豆在恢復期內，SOD活性均顯著高于對照值（P＜0.005），且前24 h高濃度O3處理SOD活性顯著高于低濃度O3處理（圖2a）。CAT含量在低濃度處理后恢復4 h時達到最大值，高濃度處理恢復8 h時達到最大值（圖2b）。表明低濃度O3處理對SOD、CAT活性可能存在馴化，植株曝露到正常空氣中可迅速恢復。臭氧濃度、恢復時間以及兩者的交互處理對分枝期大豆的 SOD（P＜0.01）、CAT活性（P＜0.05）都有顯著影響。

經方差分析和多重比較，APX活性均呈先上升后下降的趨勢，低濃度處理與對照值在1 h后達到最大值，8 h后低于對照值；高濃度處理1 h后顯著低于對照值，2 h之后顯著升高（P＜0.05）（圖3a）。DHAR活性于高濃度處理下2 h后急劇上升，回落后于72 h后無顯著差異（圖3b）。MDHAR活性在高低濃度處理后1 h均顯著上升（P＜0.05），之后逐漸下降（圖3c）。GR活性在高低濃度處理下恢復期間變化趨勢與對照值相同（圖 3d）。重復測量方差分析結果表明，恢復時間、臭氧濃度及二者的交互作用對分枝期大豆ASA-GSH循環的關鍵酶：APX、DHAR、MDAR和GR活性都有顯著影響（P＜0.05）。

圖3 不同濃度臭氧處理結束后對大豆葉片AsA-GSH循環酶活性的影響Figure 3 Effects of elevated ozone pretreatment to the primary enzyme activities in AsA-GSH of soybean leaves

2.2.3 非酶抗氧化物

方差分析和多重比較結果表明，低濃度處理下，AsA呈波動變化，且均高于對照值；在高濃度處理下恢復1 h后顯著升高，隨后略有下降（圖4a）。低濃度處理下，DHA在恢復1 h后顯著降低，4 h后時達最大峰值，4—72 h后下降，但與低濃度無顯著差異；高濃度處理下恢復1 h后顯著增加了80%，之后緩慢降低（圖4c）。，低濃度處理下，AsA/DHA恢復期間與對照值無顯著差異；高濃度處理下 2 h后呈現最高值狀態（圖 4e）。低濃度處理下，GSH呈波動下降的趨勢；高濃度處理下恢復1 h后迅速下降（圖4b）。高低濃度處理下，GSSG在恢復1 h時均達到峰值（圖4d）。GSH/GSSG則在高低濃度處理下恢復1 h時顯著降低（圖4f）。重復測量方差分析結果顯示，臭氧濃度、恢復時間及兩者交互作用對分枝期大豆AsA、DHA、AsA/DHA、GSSG與GSH/GSSG均有顯著的影響（P＜0.05），對GSH、GSSG和GSH/GSSG均有極顯著的影響（P＜0.001）。

圖4 不同濃度臭氧處理結束后對大豆葉片抗壞血酸與谷胱甘肽含量的影響Figure 4 Effects of elevated ozone pretreatment to AsA and GSH content in soybean leaves

2.2.4 丙二醛

方差分析和多重比較結果表明，MDA含量在低濃度處理下與對照值不存在顯著差異；高濃度處理后1 h顯著升高（P＜0.001），之后持續下降，48 h后無顯著差異（圖5）。重復測量方差分析結果顯示，臭氧預熏蒸濃度與恢復時間對分枝期大豆葉片MDA含量均有極顯著影響（P＜0.001）。

圖5 不同濃度臭氧處理結束后對大豆葉片MDA含量的影響Figure 5 Effects of elevated ozone pretreatment to MDA content in soybean leaves

2.3 臭氧熏蒸對基因表達水平的影響

量化了分枝期大豆葉片5個CAT基因（CAT1、CAT2、CAT3、CAT4、CAT5）的轉錄水平。CAT1表達量在低濃度臭氧處理后24 h時達到最大值，高濃度處理后8 h時達到最大值，顯著上調，72 h時高低濃度處理均與對照組無顯著差異（圖6a）。CAT2表達量在高低濃度處理后均顯著上調，2 h時其表達量達到最大值（圖6b）。CAT3、CAT5相對表達量較低（圖6c、e）。CAT4表達量在低濃度處理后24 h時顯著上調；高濃度處理下8 h時顯著上調（圖6d）。

圖6 不同濃度臭氧處理結束后對大豆葉片CATs基因表達水平的影響Figure 6 Effects of elevated ozone pretreatment to CATs genes expression in soybean leaves

量化了分枝期大豆葉片3個SOD基因（Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD）的轉錄水平。Cu/Zn-SOD表達量在高低濃度處理下均顯著上調（圖7a）。Mn-SOD相對表達量在低濃度處理下0—4 h時顯著上調（圖7b）。Fe-SOD表達量總體較低，僅低濃度處理下在2—4 h顯著上調，高濃度處理下4 h時表達量顯著上調（圖7c）。

圖7 不同濃度臭氧處理結束后對大豆葉片SODs基因表達水平的影響Figure 7 Effects of elevated ozone pretreatment to SODs genes expression in soybean leaves

APX與GR都是AsA-GSH循環主要酶。分枝期大豆葉片APX表達量在低濃度處理下顯著上調，高濃度處理后2 h時表達量達到最大值，8 h后無顯著差異（圖8a）。GR表達量在高低濃度處理后1 h時顯著上調，但隨著恢復時間的延長，表達量下調（圖8b）。

圖8 不同濃度臭氧處理結束后對大豆葉片APX、GR基因表達水平的影響Figure 8 Effects of elevated ozone pretreatment to APX and GR gene expression in soybean leaves

3 討論

近 20年來，伴隨著中國城市化和工業化的快速發展，大量的溫室氣體排放到空氣中，近地層的O3濃度不斷升高，導致植物長期面臨臭氧環境的脅迫作用（Liang et al.，2021）。本研究表明，不同濃度的臭氧脅迫對大豆植株數量性狀存在差異性影響，如低濃度（80 nmol·mol-1）臭氧熏蒸后生殖指標（豆莢數和單株粒數）顯著增加，但種子百粒重下降，而高濃度（200 nmol·mol-1）熏蒸后相關指標均顯著降低。一方面表明低濃度的 O3有利于大豆受到脅迫后的資源權衡，能量傾向于生殖生長，單株種子數增加，但可能導致種子質量降低。另一方面高濃度 O3確實對大豆的生殖產生不利影響，并且葉面積、株高、地上生物量、地下生物量等營養生長指標也在脅迫下顯著降低（Malaiyandi et al.，2014；Zhang et al.，2021）。因此，處于恢復階段的大豆植株將面臨缺少光合產物積累、迅速衰老的困境。而實際生產中我們取用的是大豆的種子，對其受到臭氧脅迫后的生理響應過程進行探究成為必然的目標。

大豆經歷驟然高濃度臭氧脅迫后，大豆葉片O2·-產生速率、H2O2含量顯著升高，導致ROS爆發，造成植物氧化損傷，這印證了第一個假設（Vaultier et al.，2015）。已有研究表明，高濃度臭氧熏蒸導致小麥（Triticumaestivum）、辣椒（Capsicum annum）、食莢菜豆（Phaseolusvulgaris）、水稻（Oryza sativa）等植物葉片內 ROS含量增加（Salvatori et al.，2015；Yamaguchi et al.，2015；Pandey et al.，2018；Macias et al.，2021）。大豆在高濃度臭氧脅迫解除后進入恢復期，體內的平衡再次被打破，代謝機制又一次受到沖擊，由于過剩的活性氧水平不能及時消耗掉，所以大豆葉片 ROS水平在恢復初期仍有短暫的升高，但隨著恢復期的延長，植物逐漸適應新的平衡，體內過剩的活性氧被逐步降解。本實驗中低濃度處理下的 ROS水平活性與對照組無顯著差異。在紫外線（UV-B）照射的研究中也觀察到相似的情況（Yang et al.，2014）。

非酶促抗氧化物抗壞血酸和谷胱甘肽在植物應對脅迫時具有重要作用（Dumont et al.，2017；Karam et al.，2017）。植物還原型AsA的水平反映了抗壞血酸參與抗氧化反應的能力，代表其應對臭氧脅迫的氧化應激潛力（Calatayud et al.，2001）。本研究中，大豆在低濃度臭氧處理后的恢復期內總AsA含量增加，還原型AsA與氧化型AsA含量始終保持較高水平，表明大豆的抗氧化能力增強。與之相反，高濃度臭氧處理后AsA含量顯著降低，在恢復期呈上升趨勢，有利于加速大豆植株的修復。另外，O3脅迫可抑制抗氧化酶活性，降低了GSSG的還原比率（Mahalingam et al.，2006），導致高濃度O3處理下大豆GSSG含量急速上升。

植物抗氧化酶活性對臭氧濃度的升高的響應程度受脅迫強度、脅迫時間以及物種差異共同影響（Sim et al.，2009；Yamaguchi et al.，2015；Pellegrini et al.，2017）。本研究中，恢復期內，短期各O3處理9 d的大豆葉片SOD活性顯著高于對照。通過對Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、Fe-SOD（Bowler，1992；Perry et al.，2009；Alscher et al.，2002）3種SOD相關的基因表達研究，發現臭氧處理下大豆葉片Cu/Zn-SOD表達量處于相對較高水平，表明在修復高濃度O3造成的大豆氧化應激中，Cu/Zn-SOD的高表達對SOD活性起重要作用。CAT是一種高效的ROS清除劑（Gill et al.，2010；Qiao et al.，2015），本研究發現高濃度O3使大豆葉片CAT活性下降，但在恢復期經低濃度O3處理CAT活性升高響應比對高濃度O3處理更迅速。目前在大豆中發現的CAT基因有5種不同亞型，且在高濃度臭氧刺激下均能表達（Slupphaug et al.，2003）。大豆O3脅迫恢復期內，葉片CAT1整體相對表達量較高，CAT活性與CAT1呈顯著正相關（r=0.429），可見CAT1亞基在控制大豆O3脅迫恢復期CAT的表達發揮主要作用。不同亞型CAT基因在發揮作用時確實具有差異性表達的特點（Du et al.，2010），在大豆的臭氧脅迫中應當重點關注CAT1基因。大豆APX含量在低濃度臭氧處理后的恢復初期（0—2 h）顯著高于對照，但此時的H2O2含量及CAT活性無顯著變化，因此在恢復初期很可能是APX催化的清除H2O2反應發揮主要作用（Kaur et al.，2021）。恢復4 h時CAT活性明顯上調，催化清除H2O2能力得到增強。MDHAR和DHAR可分別將MDHA和DHA還原為ASA。恢復期間，MDHAR和DHAR活性之和與APX活性值基本相當，說明大豆葉片內AsA合成與消耗可以達到相對平衡，從而維持植物氧化還原平衡，降低ROS誘導的對植物細胞的損傷（Costa et al.，2021）。

進入恢復期后，大豆ROS經抗氧化系統清除調整后下降，緩解氧化脅迫造成的細胞膜脂損傷，MDA含量下降。同時，本研究表明，O3輕度脅迫情況下 ROS的產生和隨后的氧化信號傳導的改變可能啟動其防御機制，以減輕氧化傷害，在恢復期內大豆代謝恢復比較迅速，且SOD、CAT等抗氧化酶要顯著高于對照，抗氧化活性增強（Mahmood et al.，2021）。當脅迫強度較高時，細胞修復速率不能跟上ROS的產生速率，便會加劇氧化應激，嚴重情況下會發生不可逆轉的損傷和生理能力喪失（Rozp?dek et al.，2015；Kask et al.，2021）。

4 結論

低濃度 O3（80 nmol·mol-1）處理大豆在恢復期內，與對照相比 ROS水平下降，抗氧化酶活性升高，抗氧化物含量升高，抗氧化酶基因表達量增加，引發誘導抗性，但輕度的脅迫導致了植物資源的再權衡，生殖生長優先，單株豆莢數和種子數、單株種子重增加，造成當代大豆種子產量增加，但種子百粒重減小，種子質量可能受影響。高濃度O3（200 nmol·mol-1）處理下恢復期大豆葉片ROS水平顯著高于對照與低濃度 O3處理，抗氧化系統清除能力不能迅速緩解氧化傷害誘導產生過量ROS，只能隨著恢復期的延長，植物在適宜的環境下逐步緩解高濃度O3處理下誘導的氧化應激。但短期的重度O3處理導致大豆生殖生長受限，植株生物量、種子產量、數量均有下降。