石蒜堿通過TLR4/NF-κB途徑抑制LPS誘導的原代小膠質細胞炎癥反應

抗晶晶，曹翔，2△

神經炎癥是神經系統疾病發生發展的關鍵因素，小膠質細胞作為腦內固有的免疫效應細胞，參與神經炎癥過程［1-2］。靜息態小膠質細胞能修復損傷、維持神經網絡的正常功能；然而，微環境的變化會迅速活化小膠質細胞，過度活化的小膠質細胞主要轉化為“促炎型”和“抑炎型”兩種［3］。“促炎型”小膠質細胞分泌炎性因子加重腦損傷；而“抑炎型”小膠質細胞通過釋放神經營養因子修復神經元-膠質細胞-血管單元。因此，抑制“促炎型”小膠質細胞異常激活及其介導的炎癥反應被認為是治療神經系統相關疾病的關鍵。石蒜堿（Lycorine，LYC）是植物石蒜的主要活性成分，因其具有多種生物學效應而受到廣泛關注［4-6］。本課題組前期研究發現，LYC能夠顯著抑制脂多糖（LPS）誘導的外周巨噬細胞炎癥反應［7］。有研究證明LYC可降低大鼠腦卒中梗死體積并改善神經功能缺損，但具體機制不清［8］。有關LYC對神經炎癥，尤其是小膠質細胞表型轉換以及炎癥反應影響的研究較少。本研究旨在觀察LYC對LPS誘導的原代小膠質細胞炎癥反應和表型變化的作用，并對其機制進行探討，為神經炎癥性疾病的治療提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 材料 1～2日齡健康的SPF級C57BL/6新生小鼠60只，性別不限，體質量1.0～1.5 g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司［生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0008］。LYC（純度≥95%，CAS號2188-68-3）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。LPS購自美國Sigma公司；CCK-8、一氧化氮（NO）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗小鼠Toll樣受體4（TLR4）、核轉錄因子-κB p65亞基（NF-κB p65）、p-NF-κB p65、GAPDH抗體以及山羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling公司；CD11b（M1/70）、CD86（GL1）、CD206（MR6F3）及其同型對照流式抗體購自美國eBioscience公司；DMEM細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒以及熒光定量試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細胞裂解液和蛋白酶抑制劑購自江蘇凱基技術股份有限公司。倒置顯微鏡（型號：IX73）購自日本奧林巴斯公司；酶標儀（型號：SPARK）購自瑞士Tecan公司；熒光定量PCR儀（型號：StepOnePlus）購自美國ABI公司；凝膠成像儀（型號：1600）購自上海天能公司；流式細胞儀（型號：C6）購自美國BD公司。

1.2 原代小膠質細胞培養 取小鼠大腦皮層，加入胰蛋白酶消化10 min后吸去胰蛋白酶終止消化。將腦組織反復輕柔吹打成細胞懸液，經70μm濾器過濾后離心收集細胞，將細胞種于75 cm2培養瓶并放于37℃、5%CO2細胞培養箱中常規培養。培養2 d后待細胞貼壁，全部換液，繼續培養到第7天時再次全部換液。每天觀察細胞形態，第10天利用恒溫搖床，250 r/min，15 min，收集含有原代小膠質細胞的上清液進行后續實驗。將細胞分為對照組、LYC組、LPS組和LPS+LYC組。對照組細胞不做處理；LYC組細胞使用0.1、0.5、1和5μmol/L LYC處理24 h；LPS組細胞使用0.1 mg/L LPS處理24 h；LPS+LYC組細胞使用5μmol/L LYC預處理1 h后加入0.1 mg/L LPS再處理24 h。利用倒置顯微鏡觀察細胞形態并拍照記錄。

1.3 流式細胞術檢測小膠質細胞純度及LPS誘導原代小膠質細胞向兩種表型轉化情況 收集對照組、LYC組、LPS組以及LPS+LYC組的原代小膠質細胞，加入表面流式抗體（CD11b、CD86和CD206）或相應的同型對照抗體，渦旋混勻后于室溫下避光孵育15 min，PBS洗滌細胞后300 r/min離心15 min，棄去上清液加入200μL PBS重懸細胞，在流式細胞儀上進行檢測，結果采用FlowJo V10流式軟件分析。

1.4 細胞活性檢測 將對照組與LYC組細胞以5×104的密度均勻接種在96孔板中。培養24 h后棄舊培養基，再加入含有10%CCK-8溶液的新鮮培養基，于37℃孵育2 h后置于酶標儀450 nm波長下檢測吸光度值。

1.5 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測炎性因子和不同表型小膠質細胞表面標志物mRNA表達 按RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA并進行逆轉錄，之后在熒光定量PCR儀器上進行PCR擴增，白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等引物序列見表1，以GAPDH為內參。20μL反應體系包括2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，cDNA（50μg/L）2.0μL，滅菌水7.2μL。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃10 s，60℃30 s，共40個循環。每組設3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

Tab.1 The sequences of the primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.6 NO檢測 收集各組的細胞上清液，利用經典的Griess法測定NO含量。

1.7 免疫印跡法檢測TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達 將各組細胞用預冷PBS潤洗3遍后，加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑后在冰上裂解30 min，4℃12 500 r/min離心30 min收集上清蛋白。BCA法測定并計算蛋白濃度后取等量蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將分離的蛋白采用濕轉法轉移到PVDF膜上，之后置于5%的脫脂奶粉中封閉1 h。一抗TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65（均為1∶1 000稀釋）、GAPDH（1∶5 000）于4℃冰箱孵育過夜，次日回收一抗，PVDF膜再與山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，化學發光法于凝膠成像儀器中顯影，利用Image J軟件分析結果。

1.8 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。數據采用±s表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LYC對原代小膠質細胞活性的影響 流式細胞術結果示CD11b陽性的原代小膠質細胞占總細胞的95%以上，見圖1，滿足實驗要求。對照組，0.1、0.5、1和5μmol/L LYC組細胞活性分別為1.000±0.037、1.023±0.024、1.064±0.121、0.960±0.022和1.026±0.038，差異無統計學意義（n=4，F=1.598，P＞0.05）。為研究LYC的最大有效劑量，后續研究均以5μmol/L的LYC為藥物濃度。LYC組小膠質細胞的形態并未改變，但是LPS組小膠質細胞突起縮短變厚，胞體增大，呈現阿米巴樣，LPS+LYC組阿米巴樣小膠質細胞數量明顯減少，見圖2。

Fig.1 Purity verification of primary microglia cells圖1 原代小膠質細胞純度驗證

2.2 LYC對原代小膠質細胞炎性因子mRNA表達水平及NO含量的影響 與對照組相比，LPS組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平以及NO含量的表達升高（P＜0.01）；與LPS組比較，LPS+LYC組以上炎性細胞因子表達水平和NO含量降低（P＜0.01），見表2。

2.3 LYC對小膠質細胞CD86、CD206 mRNA和表型比例的影響 與對照組相比，LPS組CD86和CD206 mRNA表達水平和表型比例升高（P＜0.01）；與LPS組比較，LPS+LYC組CD86 mRNA表達水平和表型比例降低，CD206 mRNA表達水平和表型比例升高（P＜0.01）。見表3，圖3。

Fig.2 Effects of LYC on the morphology of primary microglia cells(×200)圖2 LYC對原代小膠質細胞形態的影響（×200）

Tab.2 Comparison of IL-1β,IL-6 and TNF-αmRNA expression level and NO content between the four groups表2各組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平及NO含量比較 （n=4，μmol/L，±s）

Tab.2 Comparison of IL-1β,IL-6 and TNF-αmRNA expression level and NO content between the four groups表2各組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平及NO含量比較 （n=4，μmol/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與LPS組比較，P＜0.01；表3、4同。

組別對照組LYC組LPS組LPS+LYC組F IL-1βmRNA 1.026±0.137 1.135±0.507 1 357.000±186.300a 631.900±83.950ab 159.500＊＊IL-6 mRNA 1.047±0.118 1.032±0.156 3 644.000±391.400a 1 549.000±267.200ab 212.000＊＊組別對照組LYC組LPS組LPS+LYC組F TNF-αmRNA 1.036±0.128 1.136±0.508 397.700±62.410a 248.800±45.230ab 103.100＊＊NO含量1.185±0.366 2.238±0.949 28.770±2.472a 18.830±4.847ab 93.640＊＊

Tab.3 Comparison of CD86 and CD206 mRNA expressionlevels and phenotypic ratio between the four groups表3各組CD86和CD206 mRNA表達水平和表型比例比較 （n=4，±s）

Tab.3 Comparison of CD86 and CD206 mRNA expressionlevels and phenotypic ratio between the four groups表3各組CD86和CD206 mRNA表達水平和表型比例比較 （n=4，±s）

組別對照組LYC組LPS組LPS+LYC組F CD86 mRNA 0.921±0.062 0.741±0.207 6.003±1.094a 3.427±0.542ab 63.910＊＊CD206 mRNA 1.190±0.419 0.972±0.278 3.682±0.584a 6.200±0.695ab 89.730＊＊CD86（%）9.150±0.387 9.020±0.486 36.150±2.525a 22.400±2.754ab 186.600＊＊CD206（%）8.463±0.697 8.850±0.265 16.680±1.396a 25.150±1.234ab 246.500＊＊

Fig.3 The flow cytometry results of LYC on different phenotypic primary microglia cells induced by LPS圖3 LYC對LPS誘導的原代小膠質細胞不同表型的流式圖

2.4 LYC對LPS誘導的原代小膠質細胞TLR4/NFκB信號通路的影響 與對照組相比，LPS組TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達水平升高（P＜0.01）；與LPS組比較，LPS+LYC組TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達水平降低（P＜0.01），見圖4，表4。

Fig.4 Effects of LYC on TLR4/NF-κB signaling pathway in LPS-induced primary microglia cells圖4 LYC對LPS誘導的原代小膠質細TLR4/NF-κB信號通路的影響

3 討論

小膠質細胞介導的神經炎癥已被證實是神經退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森及腦卒中預后的重要因素。研究表明，活化的小膠質細胞釋放的炎癥介質能促進β-淀粉樣蛋白（Aβ）產生和積累［9］。帕金森死亡患者腦組織中可以檢測到小膠質細胞的異常激活以及相關的炎性細胞因子釋放［10］。過度激活的小膠質細胞在腦卒中早期和晚期的繼發性損傷中起到關鍵作用，加重腦損傷［11-12］。因此，干預小膠質細胞介導的炎癥反應是治療以上神經系統疾病的有效方法。

Tab.4 Comparison of TLR4/NF-κB signaling pathway protein expression levels between the four groups表4 各組TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of TLR4/NF-κB signaling pathway protein expression levels between the four groups表4 各組TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達水平比較（n=3，±s）

組別對照組LYC組LPS組LPS+LYC組F TLR4 0.992±0.153 1.391±0.180 2.547±0.016a 1.665±0.207ab 52.930＊＊p-NF-κB p65 1.000±0.064 1.139±0.063 2.214±0.242a 1.246±0.384b 17.070＊＊

石蒜是一味中草藥，主要生長在我國長江以南地區。LYC是石蒜提取物中最主要的活性物質，本質上是一種吡咯并菲啶的環形生物堿。研究發現，LYC能抑制腫瘤細胞轉移和細胞周期進程，促進腫瘤細胞凋亡［4，13］。近年有研究表明，LYC能劑量依賴性地抑制感染細胞中新型冠狀病毒的復制［14］。炎癥方面，LYC被證實能夠減少LPS誘導的骨丟失［15］。同時，筆者之前的研究發現LYC具有改善外周巨噬細胞炎癥反應的能力［7］。然而關于LYC對小膠質細胞介導的炎癥反應的作用甚少。本研究的結果顯示，LPS刺激可促使小膠質細胞向阿米巴樣轉變，增加了炎性細胞因子的表達以及“促炎型”小膠質細胞的比例，而LYC可以改善原代小膠質細胞的形態，抑制炎性細胞因子表達，并提高“抑炎型”小膠質細胞的比例。這些結果提示LYC具有拮抗LPS誘導的小膠質細胞炎癥反應的能力，且與其促進小膠質細胞由“促炎型”向“抑炎型”的轉化有關。

目前，大量研究表明多個信號通路在小膠質細胞表型轉化中發揮作用。Li等［16］發現環狀RNAPrkcsh通過JNK/p38 MAPK通路促進小膠質細胞向“脊髓損傷”型極化。有關系統性紅斑狼瘡的研究發現，丙酮酸激酶通過β-catenin信號通路促進小膠質細胞向“吞噬型”轉化，破壞認知功能［17］。TLR4/NFκB是目前被研究較多且明確與小膠質細胞表型轉化有關的通路。TLR4作為LPS的受體，其在腦內大量表達于小膠質細胞［18］。TLR4被激活后在細胞質內形成復合體，繼而通過磷酸化NF-κB將信號傳遞到細胞核內。磷酸化的NF-κB啟動細胞核中下游相關基因的轉錄，生成相應的mRNA，合成炎性因子和控制小膠質細胞表型轉化的蛋白，引起一系列炎癥反應［19］。本研究結果顯示，LPS刺激增加了TLR4的表達和NF-κB p65的磷酸化水平，而LYC可以逆轉這一現象，提示LYC可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，抑制小膠質細胞向“促炎型”轉化，進而降低促炎細胞因子的表達，減輕炎癥反應。

綜上所述，LYC能減輕LPS所致的小膠質細胞炎癥反應，可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來實現的。本研究為開發LYC作為一種新的神經系統疾病保護藥物提供了實驗依據。