烏司他丁緩解子癇前期大鼠高血壓、蛋白尿和炎癥反應的實驗研究

董彥，崔劍，張麗，郎楠，王建波，于志強

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是指妊娠20周以后新出現的血壓升高或原有的高血壓加重，常伴有蛋白尿和其他多器官、多系統癥狀的疾病［1］。PE的發病率為2%～8%，可引起子癇、腎功能不全、HELLP（hemolysis,elevated liver enzymes,low plateled syndrome）綜合征、胎兒生長受限、胎兒窘迫、胎盤早剝及胎死宮內等嚴重的并發癥，是孕產婦和圍產兒死亡的主要原因之一［2］。PE的病因和發病機制尚未完全闡明，其中子宮螺旋動脈滋養細胞重鑄障礙，導致胎盤缺血、缺氧并釋放多種胎盤因子進入母體血液循環，引起全身炎癥反應和血管內皮細胞損傷是PE的重要特征［3］。目前，PE缺乏有效的對因治療，只能對癥治療以減輕癥狀，選擇適當的時機終止妊娠。因此，針對PE的病因和發病機制，積極尋找治療或減緩PE的策略，對保證孕產婦和圍產兒的安全具有重要意義。

烏司他丁（Ulinastatin，UTI）是從人體尿液中提取的一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制機體釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8等炎性介質，緩解機體的炎癥反應，改善血管內皮細胞功能，已有效用于重癥胰腺炎、膿毒血癥及感染性休克等炎性疾病的治療［4］。但UTI能否抑制PE中的炎癥反應，目前尚不清楚。本研究通過建立PE大鼠模型，研究UTI能否通過降低PE大鼠血漿和胎盤中炎性介質水平，減輕血管內皮細胞損傷，從而改善PE大鼠的癥狀，以期為PE的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 孕（gestation，G）12 d（G12）SD大鼠購自北京斯貝福生物科技有限公司，SPF級，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0002。共56只，體質量230～270 g，分籠飼養于室溫22～24℃、標準清潔、空氣流通、晝夜交替循環的環境中，可自由進食、飲水。本研究中所有動物相關操作均遵循國際標準的動物實驗管理條例。

1.1.2 主要試劑與儀器 血漿TNF-α、IL-6、血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。兔源TNF-α、vWF、PLGF抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司。兔源IL-6抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。兔源β-Tubulin抗體、所有兔源二抗、磷酸鹽緩沖液（PBS）、檸檬酸鈉抗原修復液、中性樹膠等均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組及PE模型的建立 隨機數字表法將56只大鼠隨機分為對照（C）組、PE組、PE+U1組、PE+U2組，每組14只。PE組大鼠分別于G13～G19腹腔注射左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME，上海博湖生物科技有限公司）200 mg·kg-1·d-1，建立PE模型,C組注射等量生理鹽水。PE+U1組和PE+U2組大鼠于G13～G19腹腔注射L-NAME 200 mg·kg-1·d-1，同時分別腹腔注射UTI 5 000和10 000 IU·kg-1·d-1，C組、PE組注射等量生理鹽水。

1.2.2 孕鼠血壓和24 h尿蛋白測定 4組大鼠均于G12、G13、G15、G17、G19采用大鼠尾套無創血壓儀測量尾動脈收縮壓（SBP）。測量前先把孕鼠置于預熱箱內預熱至38～40℃，待其安靜后測量。每只大鼠測量3次，取平均值。分別于G12和G19用標準代謝籠收集24 h尿液，以考馬斯亮藍染色（上海瑞番生物科技有限公司）測定24 h尿蛋白水平。

1.2.3 取材 所有大鼠于G20時在七氟醚麻醉下行剖宮產術，獲取胎盤組織，同時于腹主動脈采集血液標本。

1.2.4 血漿中TNF-α、IL-6、vWF、PLGF水平測定 取血標本6 mL置入含EDTA抗凝劑的試管中，充分混勻后3 000 r/min離心20 min，取上清液，采用ELISA法測定血漿中TNF-α、IL-6、vWF、PLGF水平。所有大鼠中，C、PE+U1和PE+U2組中均有7例，PE組中有6例血標本量達到6 mL，其余大鼠血標本量未達到實驗要求。

1.2.5 Western blot檢測胎盤中TNF-α、PLGF、IL-6、vWF蛋白表達 將胎盤組織放入EP管內，加入RIPA裂解液，組織剪碎后以超聲處理。超聲處理后的組織液置于4℃冰箱中靜置30 min，4℃、16 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）后進行轉膜，加入TNF-α、PLGF、IL-6、vWF一抗（均為1∶1 000稀釋）。4℃孵育過夜，漂洗后加入二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，將化學發光試劑A液與B液等量混合，孵育PVDF膜1 min，于凝膠成像儀中成像。使用Image J軟件進行灰度分析。通過計算目的條帶與內參蛋白β-Tubulin的比值，計算目的蛋白TNF-α、PLGF、IL-6、vWF的相對表達量，分析各實驗組目的蛋白的表達變化。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 9軟件進行數據分析，正態分布資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間的多重比較采用Bonferroni檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UTI對PE大鼠血壓和24 h尿蛋白的影響 56只孕鼠中有4只注射L-NAME后出現流產，其中PE組2只，PE+U1和PE+U2組各1只。G12時，各組大鼠SBP和尿蛋白水平差異均無統計學意義（P＞0.05）；G13～G19時，PE、PE+U1和PE+U2組SBP均較C組升高，PE+U1和PE+U2組SBP較PE組降低，G19時PE+U2組降低SBP的作用更明顯（P＜0.05）。G19時，PE、PE+U1和PE+U2組尿蛋白水平均較C組升高，PE+U1和PE+U2組尿蛋白水平較PE組降低，PE+U2組降低尿蛋白的作用更明顯（P＜0.05）。見表1、2。

Tab.1 Comparison of SBP of rats during different gestation between the four groups表1 各組大鼠不同孕期SBP水平比較（mmHg，±s）

Tab.1 Comparison of SBP of rats during different gestation between the four groups表1 各組大鼠不同孕期SBP水平比較（mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；1 mmHg=0.133 kPa；a與C組比較，b與PE組比較，c與PE+U1組比較，P＜0.05。

組別C組PE組PE+U1組PE+U2組F n 14 12 13 13 G12 112.86±5.87 111.75±5.97 110.15±7.14 113.39±5.32 0.716 G13 110.14±6.06 133.53±6.61a 123.92±7.19ab 118.23±8.88ab 23.670＊＊組別C組PE組PE+U1組PE+U2組F G15 110.79±5.83 147.00±5.78a 128.23±8.06ab 122.02±6.04ab 69.610＊＊G17 111.29±4.84 142.58±6.67a 126.69±7.78ab 120.00±7.70ab 47.980＊＊G19 116.50±6.50 144.67±4.36a 129.92±7.15ab 123.31±5.62abc 50.460＊＊

Tab.2 Comparison of 24-hour urinary protein levels of rats on G12 and G19 between the four groups表2 各組大鼠G12和G20 24 h尿蛋白水平的比較（mg，±s）

Tab.2 Comparison of 24-hour urinary protein levels of rats on G12 and G19 between the four groups表2 各組大鼠G12和G20 24 h尿蛋白水平的比較（mg，±s）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與PE組比較，c與PE+U1組比較，P＜0.05。

組別C組PE組PE+U1組PE+U2組F n 14 12 13 13 G12 91.07±12.60 84.25±9.95 91.23±10.37 84.46±10.34 1.673 G19 89.71±11.65 140.42±14.36a 128.08±8.56ab 100.85±11.16abc 51.350＊＊

2.2 UTI對PE大鼠炎癥指標的影響 G20時，與C組相比，PE組、PE+U1組血漿和胎盤中TNF-α、IL-6水平升高，PE+U2組僅胎盤中TNF-α水平升高（P＜0.05）；與PE組相比，PE+U1、PE+U2組血漿和胎盤中TNF-α、IL-6水平均降低（P＜0.05）；與PE+U1組相比，PE+U2組血漿和胎盤中TNF-α水平、胎盤中IL-6水平降低（P＜0.05），但血漿中IL-6水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表3，圖1。

2.3 UTI對血管內皮損傷指標的影響 G20時，與C組相比，PE組、PE+U1組血漿和胎盤中PLGF水平降低、vWF水平升高，PE+U2組僅血漿和胎盤中vWF水平升高（P＜0.05）；與PE組相比，PE+U1、PE+U2組血漿和胎盤中PLGF水平升高，vWF水平降低（P＜0.05）；與PE+U1組相比，PE+U2組血漿和胎盤中vWF水平降低（P＜0.05），但血漿和胎盤中PLGF水平差異無統計學意義（P＞0.05）；見表4，圖1。

Tab.3 Comparison of inflammatory cytokines levels in plasma and placenta between the four groups表3 各組大鼠血漿和胎盤中炎性因子水平的比較（±s）

Tab.3 Comparison of inflammatory cytokines levels in plasma and placenta between the four groups表3 各組大鼠血漿和胎盤中炎性因子水平的比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與PE組比較，c與PE+U1組比較，P＜0.05。

組別C組PE組PE+U1組PE+U2組F n7 6 7 7血漿TNF-α（ng/L）21.64±6.43 69.94±12.92a 49.55±10.59ab 34.05±6.02bc 32.660＊＊IL-6（ng/L）16.80±4.94 41.37±7.83a 27.01±4.62ab 19.97±2.97b 25.790＊＊n 14 12 13 13胎盤TNF-α 0.31±0.14 1.06±0.09a 0.87±0.11ab 0.71±0.12abc 95.860＊＊IL-6 0.40±0.09 0.97±0.21a 0.68±0.18ab 0.51±0.11bc 34.580＊＊

Fig.1 Expressions of TNF-α,IL-6,vWF and PLGF proteins in placental tissue in the four groups圖1 4組大鼠胎盤組織中TNF-α、IL-6、vWF、PLGF的蛋白表達

Tab.4 Comparison of vascular endothelial injury marker levels in plasma and placenta between the four groups表4 各組大鼠血漿和胎盤中血管內皮損傷指標比較（±s）

Tab.4 Comparison of vascular endothelial injury marker levels in plasma and placenta between the four groups表4 各組大鼠血漿和胎盤中血管內皮損傷指標比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與PE組比較，c與PE+U1組比較，P＜0.05。

組別C組PE組PE+U1組PE+U2組F n7 6 7 7血漿vWF（μg/L）0.66±0.29 1.81±0.57a 1.19±0.18ab 0.98±0.10abc 13.440＊＊PLGF（ng/L）184.54±38.00 94.48±34.75a 144.99±11.43ab 160.96±13.28b 12.660＊＊n 14 12 13 13胎盤vWF 0.24±0.07 0.61±0.10a 0.47±0.11ab 0.36±0.09abc 36.660＊＊PLGF 0.56±0.10 0.24±0.13a 0.39±0.07ab 0.48±0.07b 26.420＊＊

3 討論

3.1 PE的發病與全身和胎盤的炎癥反應有關 PE是妊娠期特有的疾病，其發病機制與全身和胎盤的炎癥反應及胎盤血管的形成異常有關。全球每年約有76 000例產婦和500 000例胎兒及新生兒死于PE相關疾病［5］。研究表明，與正常妊娠或非孕期的育齡女性相比，PE患者體內炎性因子水平增加，有血管內皮功能障礙［6］。PE患者血漿中TNF-α和IL-6水平明顯高于正常妊娠女性，且兩者的血漿水平被認為是評價PE患者預后的指標之一［7］。因此，TNFα和IL-6在PE的發生、發展過程中發揮了重要作用。

炎癥存在時TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞產生，并進一步增加IL-6等其他細胞因子和趨化因子的生成［8］。體內和胎盤中TNF-α、IL-6等炎性因子增加后，引起氧化應激反應，降低一氧化氮生物利用度，導致細小血管收縮和PE的發生；過多的TNF-α增加血管通透性，特異性地抑制滋養層細胞遷移和整合到內皮細胞中，促進淋巴細胞活化和成纖維細胞增殖，進一步引起血管痙攣，影響胎盤血供［9］。因此，抑制炎性介質的產生可能有益于PE的治療。

3.2 UTI抑制血漿及胎盤中的炎癥反應 UTI是一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制劑，存在于尿液、血漿以及所有主要器官。UTI可明顯抑制感染性動物模型中TNF-α和IL-6的分泌，抑制蛋白水解酶活性和炎性細胞因子的釋放，清除氧自由基，穩定溶酶體膜［10］。臨床研究發現，UTI可通過下調TNF-α和IL-6的表達，緩解膿毒癥導致的急性肺損傷［11］。體外研究發現，在人臍靜脈血管內皮細胞中加入TNF-α或重度PE患者血清后，血管內皮細胞凋亡數量增多，體外培養體系中加入UTI可降低血管內皮細胞凋亡率，表明UTI可阻斷炎性因子對PE血管內皮細胞的損傷［12］。

本研究發現，UTI可緩解PE大鼠的高血壓、降低尿蛋白水平、改善大鼠受損的腎功能，并降低血漿及胎盤vWF水平。其原因可能為：UTI降低PE大鼠血漿及胎盤中炎性介質（TNF-α、IL-6）水平，抑制胎盤的炎癥反應；降低炎性介質引起的血管內皮細胞高通透性，保護血管內皮的完整性，緩解血管痙攣和全身炎癥性血管內皮水腫。UTI緩解PE的可能機制：UTI通過抑制蛋白水解酶、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）活性，減少巨噬細胞釋放TNF-α、IL-6等炎性介質；通過抑制核轉錄因子活性減少TNF-α和IL-6等炎性介質生成；通過RhoA/ROCK信號通路減輕TNF-α引起的血管內皮細胞損傷［13］。

3.3 UTI減輕PE胎盤血管內皮的損傷 PLGF是血管內皮生長因子家族的成員之一，在血管生成中有促進胎盤血管發育和成熟的作用［14］。重度PE患者血清和胎盤中的PLGF水平明顯低于輕度PE患者和血壓正常的女性；妊娠晚期母體PLGF水平較低時，妊娠期高血壓、圍產期不良結局以及胎兒生長受限的發生率均增加［15］。vWF是由內皮細胞合成并分泌的一種具有黏附功能的糖蛋白，在正常孕婦體內輕度升高，在重度PE患者體內明顯升高。當血管內皮細胞受損時，vWF釋放到血液中，故血漿vWF水平升高可作為反映血管內皮細胞受損的指標［16］。本研究發現UTI能降低PE大鼠血漿及胎盤vWF水平、提升PLGF水平，故推測UTI可減輕血管內皮的損傷，改善胎盤血管的發育和胎盤的供血，其機制可能與UTI抑制血漿和胎盤中的炎癥反應有關。同時，本研究發現，10 000 IU·kg-1·d-1UTI在降低血漿和胎盤中炎性介質水平、抑制vWF釋放、緩解蛋白尿等作用方面優于5 000 IU·kg-1·d-1。然而，在緩解高血壓時2種劑量差別微弱，僅在孕晚期（G19）時有差異。

3.4 UTI用于PE的應用前景 國內外關于UTI用于產科患者的研究較少，陰道內注射UTI可預防宮頸縮短合并下生殖道炎癥引發的早產［17］。不伴有妊娠期高血壓的產婦，圍術期預防性靜脈滴注UTI 5 000 IU·kg-1·d-1可改善剖宮產術中的高凝血狀態，有助于預防術后深靜脈血栓形成［18］。本課題組既往研究發現，UTI可降低重度PE剖宮產術患者血漿vWF水平，推測UTI可減輕患者血管內皮損傷，有利于PE的治療［19］。然而，該研究僅限于胎兒娩出后（斷臍后）單次用藥，缺乏妊娠期間重復用藥的觀察，無法系統性地研究UTI的作用機制及評價治療效果。人類PE的發病機制是復雜的、多因素的，不同于注射L-NAME建立的PE大鼠模型。因此，UTI能否安全有效地用于預防和治療人類PE，仍需進一步審慎地研究。