足月新生兒黃疸與維生素D及NADSYN1基因多態(tài)性的相關(guān)性研究

李國旭，王萍，周偉瑋，崔曉玉，張芳，舒劍波，劉洋△

新生兒黃疸是新生兒時期常見的癥狀之一，可見于60%以上的正常新生兒［1］。較高的膽紅素水平可產(chǎn)生不可逆的腦損傷，遠(yuǎn)期常遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，重者可導(dǎo)致死亡［2］。因此，對于新生兒高膽紅素血癥及其高危因素進(jìn)行早期識別和干預(yù)尤為重要。維生素D（VD）在兒童生長發(fā)育及疾病進(jìn)程中均起到了非常重要的作用［3］。VD缺乏與新生兒黃疸均是新生兒期常見的問題，但有關(guān)新生兒黃疸與VD關(guān)系的研究較少。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）參與線粒體代謝、細(xì)胞分裂、免疫應(yīng)答等過程［4］。NADSYN1基因編碼的NAD合成酶1是NAD合成的關(guān)鍵酶，近年逐漸成為研究VD遺傳因素的熱點之一［5］。高分辨熔解曲線（HRM）由于其操作簡單、特異性高等優(yōu)點，常用于疾病診斷、耐藥基因篩查等領(lǐng)域［6］。本研究利用HRM檢測VD相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性。國內(nèi)外關(guān)于VD與新生兒黃疸的研究較少，且結(jié)果存在一定差異。有研究證實高膽紅素血癥患兒的VD水平低于正常新生兒［7-8］，但也有研究證實兩者間無明顯差異［9］。本文通過研究足月新生兒黃疸、維生素D水平及NADSYN1基因rs12785878位點單核苷酸多態(tài)性之間的關(guān)系，及新生兒高膽紅素血癥的危險因素，為查找新生兒黃疸的病因提供新思路，以提高醫(yī)務(wù)人員對足月新生兒高膽紅素血癥的認(rèn)識。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2019年5月—2020年8月于天津市兒童醫(yī)院新生兒內(nèi)科住院的216例伴有黃疸的足月新生兒作為研究對象，包括男117例，女99例，日齡1～30 d，出生體質(zhì)量2 750～4 000 g，出生孕周37～41+5周。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院查體存在皮膚黃染表現(xiàn)。（2）胎齡≥37周，且＜42周。（3）出生體質(zhì)量≥2 500 g，且＜4 000 g。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重缺氧。（2）新生兒敗血癥、新生兒化膿性腦膜炎等重癥感染。（3）先天性肝膽疾病，如先天性膽汁淤積、膽道閉鎖等。（4）由同族免疫性溶血、紅細(xì)胞膜或酶異常性疾病等引起的高膽紅素血癥。（5）先天免疫性疾病。（6）甲狀腺功能異常。（7）肝、腎功能衰竭等重大疾病。（8）遺傳代謝性疾病，如甲基丙二酸血癥、Citrin缺陷病等。本研究獲得本院倫理委員會審批（審批號：KY2020-40）。

1.2 方法

1.2.1 分組標(biāo)準(zhǔn) 參照《實用新生兒學(xué)》及《實用兒科學(xué)》的相關(guān)表述，足月兒生理性黃疸多于2周內(nèi)消退，且總膽紅素不超過221μmol/L。根據(jù)患兒的入院日齡（≤14 d、＞14 d）和總膽紅素（TBIL）水平進(jìn)行分組如下：（1）日齡≤14 d組，包括高膽組1（TBIL＞221μmol/L）和對照組1（TBIL≤221μmol/L）；（2）日齡＞14 d，包括高膽組2（TBIL＞34.2μmol/L）和對照組2（TBIL≤34.2μmol/L）。

1.2.2 血清VD水平檢測 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）對血清維生素D水平進(jìn)行檢測。根據(jù)《兒童微量營養(yǎng)素缺乏防治建議》規(guī)定：新生兒VD≤15μg/L為VD缺乏，＞15μg/L且≤20μg/L為VD不足，＞20μg/L為VD正常［10］。

1.2.3 臨床相關(guān)指標(biāo)采集（1）患兒的性別、日齡、出生體質(zhì)量、胎次、感染因素、血糖、血漿蛋白、白蛋白、血酸堿度、血清VD、TBIL、直接膽紅素、間接膽紅素情況。（2）孕母的年齡、受教育程度、孕周、剖宮產(chǎn)史、母乳喂養(yǎng)情況。

1.2.4 應(yīng)用PCR-HRM進(jìn)行基因分型 通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，選擇與VD相關(guān)的NADSYN1基因rs12785878位點作為研究位點［11］。采用PCR-HRM法檢測rs12785878位點基因型。首先設(shè)計PCR引物：上游5′-GAATACCACCTTCAAATAGGGC-3′，下游5′-AGCATCTGGGCAACATCAG-3′，產(chǎn)物大小339 bp。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物送Sanger測序以獲得GG、GT、TT基因型。設(shè)計HRM引物：上游5′-CCTAAGTGCCAAGGGATCTA-3′，下游5′-AGGCTCACGAGACGATCAG-3′，產(chǎn)物大小122 bp。利用已測序基因型樣本檢驗建立的HRM的準(zhǔn)確性、特異性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 25.0軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，2組比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用M（P25，P75）描述，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料用例（%）描述，組間比較采用χ2檢驗。采用二分類Logistic回歸分析新生兒高膽紅素血癥的影響因素。樣本群體代表性分析采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體情況 ≤14 d組104例（48.1%），＞14 d組112例（51.9%）。216例患兒VD水平平均（14.98±7.62）μg/L；其中≤14 d組VD水平平均（11.56±4.89）μg/L；＞14 d組VD水平平均（18.15±8.31）μg/L。

2.2 ≤14 d組新生兒的臨床資料及高膽紅素血癥影響因素分析 高膽組1較對照組1剖宮產(chǎn)率、母乳喂養(yǎng)率、感染發(fā)生率和TBIL水平高，血漿蛋白水平低（P＜0.05），2組間VD水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。經(jīng)HRM共檢測104例患兒NADSYN1基因的基因型。以是否發(fā)生高膽紅素血癥作為因變量（是=1，否=0），以剖宮產(chǎn)、母乳喂養(yǎng)、感染（二分變量均賦值為：是=1，否=0）及血漿蛋白、VD水平作為自變量，分析104例≤14 d組新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的影響因素。結(jié)果顯示，感染、剖宮產(chǎn)與母乳喂養(yǎng)為高膽紅素血癥的危險因素，見表2。

2.3 ＞14 d組新生兒的臨床資料及高膽紅素血癥影響因素分析 高膽組2較對照組2妊娠天數(shù)少、血漿蛋白水平和VD水平低，感染發(fā)生率高、TBIL水平高（P＜0.05），見表3。經(jīng)HRM共檢測112例患兒NADSYN1基因的基因型，以是否發(fā)生高膽紅素血癥作為因變量（是=1，否=0），以感染（是=1，否=0）、妊娠天數(shù)、血漿蛋白和VD水平等為自變量，分析＞14 d組112例新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的影響因素。結(jié)果顯示，血漿蛋白降低、感染為高膽紅素血癥的危險因素，VD水平不是發(fā)生高膽紅素血癥的影響因素。見表4。

Tab.1 Comparison of clinical data between the hyperbilirubinemia group and the control group in neonates with jaundice≤14 d表1 ≤14 d新生兒高膽組與對照組的臨床資料比較

Tab.2 Analysis of risk factors of hyperbilirubinemia in neonates≤14 d表2 ≤14 d新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的影響因素分析

2.4 黃疸、VD及NADSYN1基因多態(tài)性三者間的關(guān)系 本研究共檢查了216例患兒rs12785878位點基因型，其中GG型54例，TG型101例，TT型61例，高膽組與對照組所選樣本均具有群體代表性，符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），見表5。

Tab.3 Comparison of clinical data between the hyperbilirubinemia group and the control group in neonates with jaundice＞14 d表3 ＞14 d新生兒高膽組與對照組的臨床資料比較

Tab.4 Analysis of risk factors of hyperbilirubinemia in neonates＞14 d表4 ＞14 d新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的影響因素分析

Tab.5 Hardy-Weinberg Equilibrium test at rs12785878表5 rs12785878位點基因型Hardy-Weinberg平衡檢測［實際值（理論值）］

2.4.1 高膽組與對照組rs12785878位點基因型及等位基因比較 ≤14 d組，高膽組1與對照組1間基因型、等位基因分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；＞14 d組，高膽組2與對照組2間基因型、等位基因分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），均表現(xiàn)為高膽組患兒GG型、G等位基因比例較高，見表6。

Tab.6 Comparison of rs12785878 genotype between the hyperbilirubinemia group and the control group表6 高膽組與對照組rs12785878位點基因型比較

2.4.2 rs12785878位點不同基因型VD水平的比較 ≤14 d組TT和TG基因型患兒維生素D水平明顯高于GG基因型患兒；＞14 d組中GG、TG、TT基因型新生兒的VD水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表7。

Tab.7 Comparison of VD levels between neonates with different genotypes at RS12785878 locus表7 rs12785878位點不同基因型及等位基因VD水平的比較 （μg/L，±s）

Tab.7 Comparison of VD levels between neonates with different genotypes at RS12785878 locus表7 rs12785878位點不同基因型及等位基因VD水平的比較 （μg/L，±s）

＊P＜0.05；a與GG基因型比較，P＜0.05。

基因型GG型TG型TT型F n n 28 46 30≤14 d組VD水平9.62±4.24 12.05±4.81a 12.61±5.23a 3.239＊26 55 31＞14 d組VD水平17.28±7.57 17.79±8.30 19.53±9.00 0.621

3 討論

新生兒黃疸的發(fā)生與種族、孕周、分娩方式、喂養(yǎng)方式、感染、生后體質(zhì)量下降等多種因素有關(guān)［12-13］。患兒母親的受教育程度及社會習(xí)俗與患兒黃疸的發(fā)生發(fā)展也有著重要的關(guān)系［13］，但國內(nèi)相關(guān)研究較少。本研究通過不同日齡高膽組與對照組的研究，驗證與高膽紅素血癥有關(guān)的高危因素，為臨床醫(yī)生早期識別高膽紅素血癥提供思路。同時，本研究分析了高膽紅素血癥、VD及NADSYN1基因rs12785878位點三者間的關(guān)系，為臨床醫(yī)生診治高膽紅素血癥提供一定幫助。

3.1 高膽紅素血癥的危險因素 本研究對≤14 d組新生兒的分析顯示，感染、剖宮產(chǎn)、母乳喂養(yǎng)為高膽紅素血癥的危險因素。＞14 d組中感染、低血漿蛋白為高膽紅素血癥的危險因素。感染是黃疸的誘發(fā)及加重因素之一，一方面患兒進(jìn)食量減少，可供能量代謝減少，腸蠕動減慢，腸肝循環(huán)增加；另一方面，體內(nèi)毒素可破壞細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致溶血，同時還可抑制葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)間接膽紅素蓄積，誘發(fā)或者加重新生兒黃疸［15］。剖宮產(chǎn)引起高膽紅素血癥的機(jī)制可能與術(shù)中麻醉藥物通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)有關(guān)，麻醉藥物不僅可導(dǎo)致血漿紅細(xì)胞膜通透性增加，還可抑制胃腸蠕動［16］。母乳內(nèi)葡萄糖醛酸苷酶含量及活性升高，可通過促進(jìn)腸肝循環(huán)導(dǎo)致TBIL升高，同時母乳可影響葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)一步導(dǎo)致TBIL升高［17］。但國外也有研究表明完全母乳喂養(yǎng)與新生兒黃疸無相關(guān)性［18］。本研究結(jié)果表明，母乳喂養(yǎng)為≤14 d組新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的危險因素。由于日齡≤14 d新生兒可能存在母乳喂養(yǎng)不足、肝腸循環(huán)增加等情況，這些因素亦可以增加高膽紅素血癥的風(fēng)險［19］。因此，家長及醫(yī)務(wù)人員應(yīng)注意評估≤14 d新生兒母乳喂養(yǎng)是否充足以及新生兒的體質(zhì)量增長情況，以正確對待患兒的高危因素。血漿蛋白由肝細(xì)胞合成，主要由球蛋白和白蛋白組成。白蛋白承擔(dān)轉(zhuǎn)運游離膽紅素至肝臟完成代謝的作用，低白蛋白可能影響游離膽紅素的轉(zhuǎn)運和代謝，從而加重黃疸［20］。本研究經(jīng)多因素分析后證實，血漿蛋白水平升高是＞14 d新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的保護(hù)因素，但是單因素分析未發(fā)現(xiàn)低血漿白蛋白為發(fā)生高膽紅血癥的危險因素，后期還應(yīng)增加樣本量進(jìn)一步研究。

3.2 高膽紅素血癥與VD水平的關(guān)系 相關(guān)研究證實高膽紅素血癥與VD有著密切的關(guān)系。Mutlu等［7］比較了30例足月高膽紅素血癥嬰兒與21例對照足月嬰兒的VD水平（日齡3～10 d），發(fā)現(xiàn)高膽組VD水平明顯低于對照組（P=0.01）。Aletayeb等［8］同樣發(fā)現(xiàn)高膽組患兒VD水平顯著降低（P＜0.001）。但是，2018年伊朗的一項研究將30例足月高膽紅素血癥嬰兒與30例健康非黃疸足月嬰兒的VD水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.11）［9］。本研究顯示，≤14 d患兒，高膽組1和對照組1之間VD水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；＞14 d患兒，高膽組2和對照組2之間VD水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，當(dāng)納入多因素回歸時VD并非發(fā)生高膽紅素血癥的影響因素，本研究得到的結(jié)論支持高膽組與對照組在VD水平上無差異，但是考慮到生后14 d內(nèi)VD主要由母親VD水平?jīng)Q定，14 d后多從外界攝入VD，且VD在人體代謝周期大約為14 d［21-22］，因此可能存在一定的研究誤差，未來可進(jìn)一步完善相關(guān)變量控制，以進(jìn)一步明確兩者的關(guān)系。

3.3 rs12785878位點與VD水平的關(guān)系 全基因組關(guān)聯(lián)分析研究證實NADSYN1/DHCR7基因座與VD水平有關(guān)［11,23］。rs12785878位于NADSYN1基因內(nèi)含子區(qū)域，位于DHCR7基因附近，堿基突變類型為G＞T，突變后與VD水平升高有關(guān)［24-25］。DHCR7基因編碼7-脫氫膽固醇還原酶，該酶催化7-脫氫膽固醇生成膽固醇，7-脫氫膽固醇是VD合成的底物，因此當(dāng)該基因功能受到影響時，VD合成底物相對增多，進(jìn)而導(dǎo)致VD水平升高［26-27］。本研究中，≤14 d的TT基因型患兒VD水平明顯高于GG基因型，＞14 d患兒組則無差異，考慮理由同上文所說，＞14 d患兒多從外界攝入VD從而對結(jié)果造成影響。本研究顯示≤14 d患兒rs12785878位點GG基因型更易表現(xiàn)為低VD水平。

3.4 高膽紅素血癥與rs12785878位點SNP的關(guān)系 對高膽組患兒rs12785878位點不同基因型的分析顯示，高膽紅素血癥發(fā)生的風(fēng)險與不同基因型、等位基因組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，筆者發(fā)現(xiàn)高膽組攜帶GG基因型、G等位基因的比例更高。NAD是膽紅素合成過程中的輔酶之一，當(dāng)NADSYN1基因rs12785878位點發(fā)生G＞T時，膽紅素合成減少［28］。另有研究顯示細(xì)胞內(nèi)NAD水平下降時會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生衰老等變化，因此NAD對細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，在一定程度上可以減少紅細(xì)胞的破壞，從而減少膽紅素的生成［29］。因此推測NADSYN1基因rs12785878位點攜帶GG基因型、G等位基因的患兒更易發(fā)生高膽紅素血癥。

總之，母乳喂養(yǎng)、感染、剖宮產(chǎn)、低血漿蛋白水平為不同日齡足月新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的危險因素。臨床醫(yī)生應(yīng)正確識別這些高危因素，以提高診治水平。患兒rs12785878位點攜帶GG基因型、G等位基因更易發(fā)生高膽紅素血癥。≤14 d患兒rs12785878位點攜帶TT基因型的VD水平更高。本研究較之前國內(nèi)外關(guān)于新生兒高膽紅素血癥與VD關(guān)系的研究在一定程度上擴(kuò)大了樣本量，并包括了整個新生兒期，同時本研究有助于為新生兒黃疸的個體表型差異提供分子遺傳學(xué)水平的解釋，豐富了對新生兒高膽紅素血癥病因?qū)W的研究，可為嚴(yán)重高膽紅素血癥的預(yù)防和早期識別與診療提供參考。