斷藤益母湯抑制巨噬細胞趨化力防治急性期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機制研究*

鄭獻敏 王 輝 徐劍峰 徐澤軍 葉仁群

（廣東省深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518133）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一類高致殘和易反復(fù)發(fā)作的疾病，主要癥狀是關(guān)節(jié)畸形、疼痛、腫脹等，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。該病處于急性期時如未及時控制，可破壞關(guān)節(jié)軟骨及其周旁肌肉功能，導(dǎo)致日常活動能力丟失，嚴重威脅患者生命質(zhì)量［1］。RA屬于中醫(yī)學(xué)“尫痹”范疇。斷藤益母湯針對RA的主要病機“肝腎虧虛，風(fēng)濕瘀阻”而被研發(fā)出來［2］。研究表明，斷藤益母湯參與了包括腫瘤壞死因子（TNF）信號通路，白細胞介素-17（IL-17）通路、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路等多條途徑［3］，在新篩選的42個交集靶點中TNF、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1（IL-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）等細胞因子和組織蛋白酶是斷藤益母湯的靶蛋白，其中，TNF-α已被證實在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進程中起著關(guān)鍵作用。在2019年，陳林教授團隊在《風(fēng)濕病學(xué)年鑒》上報道了降低NF-κB信號通路的活化態(tài)，會下調(diào)巨噬細胞CXC趨化因子受體7（CXCR7）的表達，繼而抑制CXC趨化因子配體12（CXCL12）所介導(dǎo)的巨噬細胞趨化的能力，從而減少該細胞在關(guān)節(jié)滑膜聚集，緩解了滑膜炎［4］。TNF與其受體50%融合后，可活化下游NF-κB信號軸和MAPK信號軸，進一步參與調(diào)控下游蛋白。因此，本研究探討了斷藤益母湯抑制巨噬細胞趨化力防治急性期RA的生物學(xué)機制（如圖1）。現(xiàn)報告如下。

圖1 機制示意圖

1 資料與方法

1.1 病例選擇 納入標(biāo)準(zhǔn)：急性期RA的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南》［5］；RA的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合診療指南》，符合風(fēng)濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，女患者均未絕經(jīng)且非妊娠期、哺乳期，近期無生育要求；自愿參與本項研究，并簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：對本研究藥物過敏者；神異常者；有嚴重心、肝、腎等重要器官和系統(tǒng)病變者；自身有傳染病或免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 臨床資料 將深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院2018年1月至2021年1月收治的80例急性期RA患者，按隨機數(shù)字表法分為對照組與治療組各40例。對照組中男性18例，女性22例；年齡31～59歲，平均（43.61±7.08）歲；病程1～12年，平均（4.06±1.33）年。治療組中男性19例，女性21例；年齡29～62歲，平均（44.08±9.12）歲；病程1～11年，平均（4.13±0.98）年。兩組患者性別、年齡和病程等差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求且經(jīng)我院倫理委員會審批通過。

1.3 治療方法 對照組口服美洛昔康片（15 mg/次）治療，每日1次；口服氨甲蝶呤片（10 mg/次）治療，每周1次。與對照組同樣治療方案的基礎(chǔ)上，治療組聯(lián)合口服斷藤益母湯。藥物組成及服用方法：桂林產(chǎn)昆明山海棠45 g煎3.5 h，再煎川續(xù)斷15 g和益母草30 g 0.5 h，取水煎液300 mL，每日1劑，分早晚2次飯后口服，每次150 mL。兩組療程均為6周。

1.4 觀察項目 臨床特征通過觀察患者關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)和晨僵時間獲得。1）關(guān)節(jié)腫脹評估：輕微有明顯骨骼痕跡為3分；嚴重腫脹無明顯骨骼痕跡為6分；嚴重腫脹且關(guān)節(jié)受限為9分。2）關(guān)節(jié)壓痛評估：關(guān)節(jié)韌帶重壓且疼痛為3分；重壓感覺不適，可控制撤回反射6分；重壓撤回受試關(guān)節(jié)，但活動范圍受限9分。3）晨僵時間為早晨關(guān)節(jié)僵硬至消失時間。4）實驗室指標(biāo)：檢測兩組C反應(yīng)蛋白（CRP）、血沉（ESR）指標(biāo)。5）外周血單核細胞的分離與刺激：采集兩組患者抗凝血，6 h內(nèi)分離外周血中單個核細胞。具體操作步驟為：用 CD14磁珠（Miltenyi Biotec 130-050-201）分選單核細胞；用含10%胎牛血清（天杭生物141001）的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，可獲得兩組的巨噬細胞［7］。6）用 TRIzol（Invitrogen，15596026）提取兩組巨噬細胞總RNA，用微量分光光度計（Thermofisher，Nanodrop2000）檢測總RNA樣本濃度，A260/A280≥1.80為樣本合格，可用于下一步。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)說明書配成體系后，在實時熒光定量PCR儀中擴增，反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性100 s，循環(huán)1次，95℃變性15 s，60℃退火55 s，72℃延伸20 s，共42個循環(huán)。選用β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法算出TNF-α、NF-κB、CXCR7和CXCL12基因相對表達量。

引物序列由上海生工合成：β-actin上游序列，5′-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′；β-actin下游序列，5′-TAGGAGCC AGGGCAGTAATC-3′。TNF-α 上游序列，5′-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3′；TNF-α下游序列，5′-CACAGACGAATGACTCCAAAG-3′。NF-κB上游序列，5′-TGCGATCCGCTAAATGCGA-3′；NF-κB下游序列，5′-AGGCATTCATGTGGATAGGCTA-3′。CXCR7上游序列，5′-TGCATCTCTTCGACTACTCAGA-3′；CXCR7 下游序列，5′-GGCATGTTGGGACACA TCAC-3′。CXCL12 上游序列，5′-CCAGCCCTCATCC CGAG-3′；CXCL12下游序列，5′-ACATTTTCATTT CCTGCTTGGTG-3′。

7）DAS28評分：DAS28可用28個腫脹關(guān)節(jié)數(shù)（T28）、疼痛關(guān)節(jié)數(shù)（SW28）、ESR的計算來獲得，公式為：8）HAQ評分：HAQ健康評估問卷包含總體健康評估問題、殘疾指數(shù)、活動度、關(guān)節(jié)炎相關(guān)的問題以及精神健康領(lǐng)域問題。分值越高其失能程度越高，分值越低則失能程度越低。

1.5 療效標(biāo)準(zhǔn) 痊愈：疼痛完全消失，關(guān)節(jié)活動恢復(fù)至正常水平，經(jīng)過影像學(xué)檢查患者痊愈。顯效：疼痛完全消失，關(guān)節(jié)活動受到限制，經(jīng)過影像學(xué)檢查患者有好轉(zhuǎn)。有效：疼痛逐漸消失，關(guān)節(jié)活動有輕度限制。無效：疼痛未見改善，關(guān)節(jié)活動受限嚴重，影像學(xué)觀察未見改善。總療效率=［（顯效數(shù)+有效數(shù)+痊愈數(shù)）÷總數(shù)］×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，用t檢驗分析組間獨立樣本差異；用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析計數(shù)資料。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床療效比較 見表1。治療組治療后總有效率明顯高于對照組（P＜0.05）。

表1 兩組臨床療效比較（n）

2.2 兩組治療前后關(guān)節(jié)腫脹和壓痛指數(shù)、晨僵時長比較 見表2。治療組治療1周后關(guān)節(jié)腫脹開始明顯改善，且在治療6周后其改善程度優(yōu)于對照組（P＜0.05）；治療組治療3周后壓痛指數(shù)才開始明顯改善，且在治療6周后其改善程度優(yōu)于對照組（P＜0.05）；治療組治療1周后晨僵時長開始明顯改善，且各時間點的改善程度均優(yōu)于對照組（P＜0.05）。

表2 兩組關(guān)節(jié)腫脹和壓痛指數(shù)、晨僵時長比較（±s）

表2 兩組關(guān)節(jié)腫脹和壓痛指數(shù)、晨僵時長比較（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05；與本組前一時間點比較，#P＜0.05；與對照組同一時間點比較，△P＜0.05。下同。

組別治療組（n=40）對照組（n=40）時間治療前第1周第3周第6周治療前第1周第3周第6周腫脹指數(shù)（分）9.04±1.81 6.62±1.76*#5.63±1.57*#3.48±1.32*#△9.00±1.83 8.52±1.62 7.68±1.55*6.13±1.59*壓痛指數(shù)（分）5.95±0.79 4.68±1.53 3.52±0.99*2.05±1.10*#△5.87±0.99 5.56±0.53 4.49±1.12 3.85±1.16*晨僵時長（min）54.10±9.06 42.16±6.66*△36.78±5.63*#△29.36±8.40*#△54.13±8.85 50.06±6.62 46.58±7.76*41.18±5.13*#

2.3 兩組治療前后CRP、ESR、DAS28和HAQ評分比較 見表3。治療組治療3周后CRP開始明顯改善，且其改善程度優(yōu)于對照組（P＜0.05）；治療組治療1周后ESR開始明顯改善，且各時間點的改善程度均優(yōu)于對照組（P＜0.05）；治療組治療1周后DAS28評分開始明顯改善，且治療3周、6周后的改善程度均優(yōu)于對照組（P＜0.05）；治療組治療3周后HAQ評分開始明顯改善，且治療6周后的改善程度優(yōu)于對照組（P＜0.05）。

表3 兩組CRP、ESR、DAS28和HAQ評分比較（±s）

表3 兩組CRP、ESR、DAS28和HAQ評分比較（±s）

組別治療組（n=40）對照組（n=40）時間治療前第1周第3周第6周治療前第1周第3周第6周CRP（IU/mL）84.39±14.88 79.52±13.62 60.33±9.23*#△57.99±10.56*△65.78±10.32 80.68±5.50 67.83±10.98*#64.90±7.62*ESR（mm/h）65.80±7.76 50.26±10.26*△43.79±9.31*#△39.26±13.67*#△84.09±5.56 58.76±11.68 50.08±6.92*#46.52±11.13*#DAS28（分）6.48±1.08 5.28±0.83*4.56±0.72*#△3.78±1.05*#△6.52±0.68 5.36±0.98 5.07±0.37*4.26±0.62*#HAQ（分）4.31±0.89 4.07±0.62 3.31±0.47*2.87±0.75*△4.23±0.91 4.07±0.22 3.96±0.67*3.61±0.26*

2.4 兩組治療前后巨噬細胞中TNF-α、NF-κB、CXCR7和CXCL12基因表達比較 見表4。顯微鏡下觀察巨噬細胞形態(tài)，可見細胞形態(tài)不規(guī)則，較大和貼壁緊密。用實時熒光定量PCR法測定兩組細胞中基因表達發(fā)現(xiàn)，治療組治療1周后巨噬細胞TNF-α表達開始明顯降低，且各時間點的表達均低于對照組（P＜0.05）；治療組治療3周后巨噬細胞NF-κB表達開始明顯降低，且治療3周、6周后的表達均低于對照組（P＜0.05）；治療組治療1周后巨噬細胞CXCR7開始明顯降低，且治療6周后的的表達低于對照組（P＜0.05）；治療組治療1周后巨噬細胞CXCL12開始明顯降低，且各時間點的表達均低于對照組（P＜0.05）。

表4 兩組治療前后巨噬細胞中TNF-α、NF-κB、CXCR7和CXCL12基因表達比較（±s）

表4 兩組治療前后巨噬細胞中TNF-α、NF-κB、CXCR7和CXCL12基因表達比較（±s）

組別治療組（n=40）對照組（n=40）時間治療前第1周第3周第6周治療前第1周第3周第6周TNF-α 1.32±0.28 1.07±0.52*△0.86±0.21*#△0.66±0.12*#△1.30±0.26 1.26±0.27 1.05±0.64*#0.91±0.13*NF-κB 1.05±0.23 0.91±0.44 0.63±0.51*#△0.42±0.17*#△1.03±0.21 0.92±0.63 0.85±0.74 0.79±0.14*#CXCR7 1.29±0.24 1.13±0.54*0.96±0.67*0.67±0.13*△1.31±0.24 1.22±0.67 1.13±0.31*0.99±0.20*CXCL12 1.00±0.15 0.75±0.69*△0.52±0.13*#△0.37±0.15*#△1.03±0.16 0.95±0.33 0.86±0.47*0.59±0.13*#

3 討 論

RA是一類致殘率高的自身免疫病，臨床特點主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎［8-9］。該病可發(fā)于任何年齡段，多發(fā)于35～50歲，患病率為0.5%～1.0%，且女性患病率高于男性3倍［10］。RA的發(fā)病機制尚未清晰，目前還沒有一種理想的藥物可以完全治愈此類疾病。目前常用于治療RA的藥物大部分仍是西藥，雖能在一定程度上控制疾病，但副作用較多。中藥以其安全、不良反應(yīng)少和價格低廉等優(yōu)點受到廣泛關(guān)注［11］。

RA屬中醫(yī)學(xué)“歷節(jié)風(fēng)”“尫痹”范疇，是臨床高致殘性風(fēng)濕免疫疾病［12］。RA以“肝腎虧虛，風(fēng)濕瘀阻”為主要病機，有研究者在長期臨床實踐中針對此病機。研發(fā)出斷藤益母湯［13］。在廣東省名中醫(yī)陳紀(jì)藩教授創(chuàng)制的“斷藤湯”基礎(chǔ)上，林昌松教授帶領(lǐng)著團隊成員對斷藤益母湯進行了不斷優(yōu)化［14］，經(jīng)我院風(fēng)濕免疫科團隊成員進行拆方研究、增伍增效研究、配伍減毒研究，使其在治療RA上療效愈發(fā)顯著。斷藤益母湯的君藥采用祛風(fēng)除濕中藥昆明山海棠，加以補肝腎強筋骨的川續(xù)斷為輔，配伍活血利濕消腫益母草。其中，川續(xù)斷配伍益母草能達到補肝腎、補氣血、強身壯骨抑制山海棠生殖毒性的目的。斷藤益母湯全方切合RA活動期“肝腎氣血虧虛，痰濁瘀血內(nèi)停”的病機，組方配伍時兼顧正虛、外邪、瘀血和藥毒4個方面，通、補結(jié)合，體現(xiàn)傳統(tǒng)中藥復(fù)方配伍優(yōu)勢。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后，治療組總療效率明顯較對照組更高；治療組治療后的關(guān)節(jié)腫脹和壓痛指數(shù)、晨僵時長的改善程度均顯著優(yōu)于治療前和對照組；RF、CRP濃度均較治療前和對照組更低；提示斷藤益母湯能有效改善RA患者癥狀，療效滿意。臨床研究顯示，斷藤益母湯可明顯提升活動期RA患者關(guān)節(jié)功能，減輕炎癥反應(yīng)，在控制RA疾病活動的同時，還可有效改善RA骨代謝水平，抑制骨破壞，促進骨形成［15］，該研究結(jié)果與本研究基本一致。

TNF-α是保持機體免疫常態(tài)的關(guān)鍵因子，在抗腫瘤、免疫防御和炎癥反應(yīng)中都發(fā)揮重要作用。當(dāng)組織內(nèi)TNF-α在低濃度時，對機體起到防御保護作用，但在組織內(nèi)過度表達時，就會造成發(fā)炎與組織受損［16］。TNF-α主要介入了RA炎癥和骨破壞的發(fā)病機制中。TNF作為重要的促炎性細胞因子，在RA的局部滑膜炎癥、血管翳的形成和組織損傷中都起著關(guān)鍵的作用。TNF-α與受體相融合后，活化下游NF-κB信號軸，加速了一連串炎性細胞分子，如IFN-γ、IL-1、IL-6等的釋放，加重了炎癥反應(yīng)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，TNF-α可能是斷藤益母湯的關(guān)鍵靶標(biāo)［3］。因此，我們推測斷藤益母湯能通過抑制TNF-α/NF-κB信號軸，從而下調(diào)巨噬細胞CXCR7的表達，繼而抑制趨化因子CXCL12所介導(dǎo)的巨噬細胞趨化的能力，進而消除巨噬細胞在關(guān)節(jié)滑膜聚集，最終改善RA的機制。本研究發(fā)現(xiàn)：治療組巨噬細胞中TNF-α、NF-κB、CXCR7和CXCL12基因表達均較治療前和對照組更低，提示斷藤益母湯防治RA的可能機制是通過抑制巨噬細胞趨化力，減少該細胞在關(guān)節(jié)滑膜聚集，從而抑制了RA的進程。TNF-α還可以誘導(dǎo)組織因子、細胞間黏附分子、血管細胞黏附分子、環(huán)氧化酶Ⅱ和血管內(nèi)皮生長因子的表達，這些分子一起作用于血管內(nèi)皮細胞，加速白細胞進入組織，加深滑膜炎癥，加快血管翳的生成［17］；NF-κB在RA滑膜炎性反應(yīng)中起著重要作用，其在RA有滑膜細胞中廣泛表達，并與一些炎性因子如TNF-α、IL-1β的表達具有高度的一致性［18］，可見通過抑制TNF-α/NF-κB信號軸能有效地緩解RA癥狀，以上研究結(jié)論與本研究基本一致。

綜上所述，斷藤益母湯治療急性期RA患者，能有效緩解患者的疼痛，療效滿意，其機制可能是斷藤益母湯通過抑制TNF-α/NF-κB信號軸，從而下調(diào)巨噬細胞CXCR7的表達，繼而抑制趨化因子CXCL12所介導(dǎo)的巨噬細胞趨化力，進而消除巨噬細胞在關(guān)節(jié)滑膜聚集，最終達到改善RA的作用。但本研究還存在一些不足之處，選入樣本量總體偏少，仍需在后續(xù)工作中作多中心、多樣本深入研究，以提供更可靠的指導(dǎo)數(shù)據(jù)。