高效液相色譜法測(cè)定茶飲料中的咖啡因含量

寧 煒

（山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心(山西省標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量技術(shù)研究院)，山西太原 030012）

咖啡因，又稱(chēng)咖啡堿，是一種從咖啡或茶葉中提取的黃嘌呤生物堿化合物，具有使人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮的作用，適度使用可以祛除疲勞、振奮精神，然而長(zhǎng)期或超劑量攝入會(huì)對(duì)人體肝腎功能造成損害，而且其具有成癮性，停用后會(huì)出現(xiàn)身體疲乏、精神不振等癥狀[1-4]。近年來(lái)，含咖啡因成分的咖啡、茶飲料、功能性飲料等十分暢銷(xiāo)，市場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，許多茶飲料都使用了咖啡因食品添加劑，且茶葉的加入也有原料帶入的可能，因此茶飲料中咖啡因的檢測(cè)十分必要[5-7]。《茶飲料》（GB/T 21733—2008）[8]中對(duì)各類(lèi)茶飲料中的咖啡因含量均有相關(guān)規(guī)定。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料中咖啡因的測(cè)定》 （GB 5009.139—2014）[9]中規(guī)定了高效液相色譜法測(cè)定可樂(lè)型飲料、咖啡、茶飲料中咖啡因的檢測(cè)方法，推薦使用紫外檢測(cè)器（Ultraviolet Absorption Detector，UVD）或二極管陣列檢測(cè)器（Diode Array Detector，DAD），其中DAD檢測(cè)器能夠進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，更有助于準(zhǔn)確定性，減少假陽(yáng)性誤判。基于此，本研究參照GB 5009.139—2014，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定茶飲料中咖啡因含量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌茶飲料購(gòu)自某超市；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，美國(guó)飛世爾試劑公司）；氧化鎂（分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為一級(jí)超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030C 高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司）；MS105DU電子天平（精度0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；XS204電子天平（精度 0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；KQ5200DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；0.45 μm微孔水相濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Synergy超純水機(jī)（德國(guó)密理博公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制。精密稱(chēng)取19.65 mg咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋、定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中間液配制。準(zhǔn)確吸取1.0 mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用超純水稀釋、定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為196.30 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。準(zhǔn)確吸取0.3 mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配成濃度為58.89 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取 0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL容量瓶中，用超純水定容得標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為1.96 μg/mL、4.91 μg/mL、9.82 μg/mL和19.63 μg/mL；分別吸取0.03 mL、0.10 mL、0.20 mL及0.50 mL濃度為19.63 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用超純水定容得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度分別 為0.059 μg/mL、0.200 μg/mL、0.390 μg/mL及 0.980 μg/mL。

1.3.2 試樣處理過(guò)程

精密稱(chēng)取5 g樣品于10 mL比色管中，加入超純水定容至5 mL，搖勻，加入0.5 g氧化鎂，振搖，靜置，取上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：艾杰爾Promosil C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇+水（24+76），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；DAD檢測(cè)器波長(zhǎng)：272 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別將配制的質(zhì)量濃度為0.059 μg/mL、 0.200 μg/mL、0.390 μg/mL、0.980 μg/mL及1.960 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與質(zhì)量濃度為4.91 μg/mL、 9.82 μg/mL、19.63 μg/mL、58.89 μg/mL及196.30 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照1.4液相色譜條件上機(jī)測(cè)試，以咖啡因的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)測(cè)得的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，計(jì)算曲線(xiàn)方程和線(xiàn)性系數(shù)。由表1可知，咖啡因在0.059～1.960 μg/mL與4.91～196.30 μg/mL均表現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表1 咖啡因的線(xiàn)性范圍、曲線(xiàn)方程和線(xiàn)性系數(shù)

2.2 加標(biāo)回收率與重復(fù)性

準(zhǔn)確稱(chēng)取9份陰性茶飲料，結(jié)合方法的線(xiàn)性范圍向1～3號(hào)試樣中添加0.5 mL濃度為1.96 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，4～6號(hào)試樣中添加0.15 mL濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，7～9號(hào)試樣中添加0.30 mL濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2試樣處理過(guò)程操作，1.4液相色譜條件測(cè)試，計(jì)算方法的加標(biāo)回收率。由表2可知，茶飲料中咖啡因在0.196～117.782 mg/kg添加水平下，回收率為96.43%～103.31%。向陰性茶飲料中添加 0.15 mL濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定6次，考察方法的重復(fù)性（用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示），方法的重復(fù)性RSD為1.56%，具體見(jiàn)表3。由此可見(jiàn)，方法的加標(biāo)回收率與重復(fù)性均滿(mǎn)足GB/T 27404—2008[10]中的規(guī)定，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 咖啡因的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)（n=3）

表3 咖啡因的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)（n=6）

2.3 檢出限與定量限

精密稱(chēng)取5 g陰性茶飲料，加入0.15 mL濃度為1.96 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2試樣處理過(guò)程操作，1.4液相色譜條件測(cè)試，測(cè)得色譜峰響應(yīng)值大于3倍噪音，計(jì)算得出方法的檢出限為 0.059 mg/kg。根據(jù)加標(biāo)回收率試驗(yàn)中低濃度回收率結(jié)果可知中該方法中咖啡因定量限為0.2 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究參照GB 5009.139—2014，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定茶飲料中咖啡因含量的分析方法。該方法前處理過(guò)程簡(jiǎn)便，Promosil C18色譜柱分離效果好，分析速度快，使用二極管陣列檢測(cè)器可以進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法線(xiàn)性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率和精密度、檢出限與定量限等均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，可以滿(mǎn)足檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)茶飲料中咖啡因的批量快速檢測(cè)。