食品中諾如病毒流行現狀及其病毒分離方法的 研究進展

王殿夫，齊 欣，楊 宇，王 翛，麻麗丹，易佳穎

（1.遼東學院，遼寧丹東 118000；2.大連海關技術中心，遼寧大連 116000；3.大連國際旅行衛生保健中心，遼寧大連 116001；4.丹東海關綜合技術服務中心，遼寧丹東 118000；5.上海海洋大學，上海 201306）

諾如病毒（Norovirus，NoV）具有傳播速度快、傳染性強等特點，在我國被列入丙類傳染病，是造成全球病毒型急性胃腸炎及食源性疾病的主要病原體之一。據統計，73%～95%的急性胃腸炎疾病暴發均與其有關，給人們帶來嚴重的疾病負擔，甚至致人死亡，是威脅人們健康和破壞食品安全的公共衛生問題之一[1]。

NoV屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，根據衣殼蛋白（Virus particle 1，VP1）序列，分為10個基因組（Genogroup，GⅠ-GⅩ），共計48個基因型，其中GⅠ型和GⅡ型是引起人體急性胃腸炎的兩個主要基因群，并且據相關監測數據表明NoV GⅡ.4型為人群最普遍的感染源[2-4]。其傳播途徑主要包括3種，即經食源性傳播、經水源性傳播和人-人傳播。其中食源性傳播主要因食物在生產、運輸等過程中遭受污染造成，其極高的感染概率已超過現報道的任何一種食源性病毒[5]。因此，對于生食、未徹底加工或冷凍的食品更易受到NoV污染并引發食源性病毒疾病。

本文對食源性NoV在食品中的流行現狀進行了調查，同時對食品中食源性NoV的主要分離方法進行了綜述，了解近年NoV分離方法的研究進展，為防范食源性NoV疾病的暴發提供預警和參考依據，以期為提高食源性病毒檢出率提供參考。

1 NoV有關的流行概況

NoV的暴發具有明顯的季節性，多在秋冬季高發[6]。在我國通過食品媒介造成污染及潛在危害的事例屢見不鮮。2020年6月至2021年5月期間，對廣州市售牡蠣進行消費風險評估發現，牡蠣中NoV陽性檢出率為52.7%（58/110），存在較高水平NoV污染風險[7]。時沙沙等[8]對枸杞島養殖場670只貽貝樣本中NoV污染情況進行了解，檢測NoV陽性率達9.9%（66/670），得出離人類活動區域較近貽貝樣品中NoV陽性率是遠岸貽貝樣品NoV陽性率3倍的結論，表明人類活動對養殖場內貽貝中NoV的富集量具有一定影響。而據國外報道，在2016—2018年和2020年期間對阿根廷栽培的8種軟果進行檢測研究，NoV檢 測 率 為0.5%（1/184）[9]。SARMENTO等[10]對巴西某一沿海城市貝類產品中NoV進行檢測和鑒定，Nov檢出率為41.5%（32/77），以GII最為普遍，檢出率為37.7%（29/77），揭示了人類活動都受海洋環境的影響，呼吁在貝類養殖區進行NoV的監測工作，為防止食源性疾病的暴發提供預警?？梢娊鼛啄暧墒吃葱訬oV引發的急性胃腸炎疾病在國內外一直處于流行狀態，并嚴重影響人們的健康。

歐盟食品與飼料快速預警系統（Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）[11]作為食品領域重要的信息交流平臺，其通報嚴重影響被通報國的產品銷售，也給各企業帶來名譽和經濟上的雙重損失。以RASFF成員國和非成員國涉及的食源性NoV通報數進行統計（圖1），發現食源性NoV一直處于暴發階段，十年內通報數達289條，尤其在2013年、2014年、2018年和2020年較為嚴重。食源性NoV在食品中的分布情況如圖2所示，2011年至2021年食品中造成NoV污染的種類主要以貝類為主，牡蠣更是造成病毒污染的主要來源，各種軟質水果均有造成食源性NoV暴發的可能，也被列入常見的污染 源頭。

圖1 2011年至2021年RASFF數據庫中NoV在食品中的暴發情況

圖2 2011年至2021年RASFF數據庫中NoV在食品中的分布情況

根據美國疾病與預防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的統計數據[12]，2011年至2020年間，食品中水產品、軟質水果和蔬菜引起的食源性NoV暴發涉及美國39個洲，共計暴發了277次，6583人次患病，導致62人住院治療，3人死亡。2021年報告NoV季節暴發數量要低于前8年同季節暴發數量。雖暴發數量呈下降趨勢，但在高風險食品媒介中仍存在病毒感染的風險。

2 食源性NoV的檢測方法概況

食源性NoV常常在食品和水中被檢出。食品中NoV的感染途徑主要包括3種，即海產品中貝類被感染，新鮮的產品在收獲、生產或包裝的過程中被污染以及即食食品在制備加工過程中被污染。目前，國際上針對NoV檢測的通用標準為ISO 15216—2：2019，標準檢測方法適用于軟果蔬菜、硬質食品表面、瓶裝水和貝類，同時該標準中對超出此適用范圍的檢測也進行了說明，需要試驗人員驗證方法的有效性。而我國針對食源性NoV檢測方法主要分為兩類，一類為采用實時熒光PT-PCR法的定性檢測，包括食品安全國家標準GB 4789.42—2016和行業標準SN/T 4784—2017，除國標中不涵蓋瓶裝水檢測范圍，其他基質范圍均與國際標準相一致；另一類為定量檢測，包括行業標準SN/T 5325.1—2020，適用范圍為貝類、硬質表面食品、生食蔬菜和軟質水果。從各種檢測方法可以看出，NoV的檢測會因各種食品基質所含復雜成分不同而存在大量RT-PCR抑制劑，影響核酸提取效率，同時NoV在食品中往往以低拷貝狀態存在并可致病，因此食品基質的洗脫和富集過程對病毒的準確檢出尤為重要，直接影響結果的準確性。

3 食品中NoV的洗脫和富集

隨著世界貿易的發展，食品產品開始多樣化，存在的污染風險也越來越多，不僅貝類、軟質水果和蔬菜等食品中檢出NoV，在其他即食、脂肪蛋白質類等食品中也能檢出NoV。目前，針對食源性NoV核酸提取和擴增技術已經較為成熟，而由于食品中各種樣品基質成分復雜，NoV的分離方法還處于不斷摸索和研究階段。因此，病毒的洗脫和富集過程成為提高NoV檢出率的關鍵。不同食品中NoV分離方法的比較見表1。

表1 不同食品中NoV分離方法的比較

3.1 病毒的洗脫

食品中的NoV不能在體外常規培養且含量低，需將食品中的病毒粒子轉移至不同種類的洗脫液中再進行病毒的富集濃縮過程。洗脫液中的pH值對洗脫效果有一定影響，通常在堿性條件下（pH值為9.0～10.5），病毒粒子和食品表面的結合能力要弱于酸性環境，帶負電的病毒粒子可與氨基酸吸附，將病毒粒子與食品分開，完成病毒粒子的洗脫過程。

現常用洗脫液分有機和無機兩種。有機洗脫液中Tris-甘氨酸-牛肉浸提物洗脫液（Tris-Glycine-Beef Extract，TGBE）和胰蛋白胨磷酸酶洗脫液（Tryptose Phosphate Broth，TPB）較為常見。TGBE是一種使用最為廣泛的洗脫液，也是國際標準ISO 15216—2中建議采用的洗脫液；TPB洗脫液為加拿大健康中心推薦使用的洗液。磷酸鹽類、碳酸鹽類和氫氧化鈉洗脫液則為常見的無機洗脫液。王宏等[13]和王飛等[14]分別采用不同的洗脫液洗脫酸性水果表面的病毒粒子時均發現，TGBE洗脫液得到病毒粒子洗脫率最高、緩沖能力最好，分析原因不是由于洗脫液不同，而是不同洗脫液之間pH值存在較大區別，造成洗脫效果不同，pH值偏堿性的洗脫液更適合于酸性水果的洗脫過程。阮佳等[15]考察了不同pH值條件下，甘氨酸洗脫液對萵苣中NoV洗脫效果的影響，結果表明甘氨酸洗脫pH值不同，NoV回收率不同，當采用pH值 5.0的甘氨酸洗脫液洗脫時病毒回收率最高。由此可見，pH值在病毒粒子洗脫效果中起重要作用，直接影響NoV的檢測結果。

3.2 病毒的富集

各類食品所含的成分不同，經過加工處理的食品更是含有許多不同種類的有機化學物質，它們在食品上的吸附和沉淀也各不相同，對病毒的回收率產生直接影響。因此，不同的食品需采用不同的病毒富集處理方法。食源性NoV常用的富集方法包括聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法、超速離心法、蛋白酶K法、超濾濃縮法、直接RNA提取法、免疫磁珠吸附法及免疫濃縮法。

3.2.1 PEG沉淀法

PEG是一種水溶性的非離子型聚合物，通過空間位置的排斥促使洗脫液中病毒粒子等微粒因減少彼此之間距離而聚集產生沉淀[16]。方法應用較為廣泛，在國外和我國國家標準中，也采用PEG沉淀法作為軟質水果和生食蔬菜基質中富集病毒粒子的方法。一般PEG的終濃度在10%～20%時，富集效果較好。管錦繡等[17]采用優化后的PEG 6000和PEG 8000偶聯作為病毒富集方法，提高了西生菜中的低劑量NoV GⅡ型回收率及檢測率。但也有研究表明，在采用PEG沉淀法富集病毒時，許多其他小分子物質會伴隨著病毒一起沉淀下來，影響后續PCR反應，導致檢測結果出現假陰性，只有有效去除提取物中的抑制劑，才能提高提取效率以達到更為理想的檢測效果。

3.2.2 超速離心法

超速離心法在病毒學研究中起著至關重要的作用，是分離純化病毒最高效、方便的技術之一。即使是再小的病毒在有足夠重力的作用下也能有效沉積。例如，病毒存在密度梯度差異時超速離心法會更有效果，可避免病毒從顆粒中再次懸浮。此方法主要應用于水果蔬菜、貝類及脂肪蛋白類食品基質的病毒富集過程。RZEZUTKA等[18]以烤豬排、腌豬肉和意大利臘腸樣品為研究對象，采用超速離心法對NoV的替代病毒貓杯狀病毒（Felinecalicivirusvirus，FCV）進行富集，FCV的回收率分別為12.5%、5.9%和3.4%，試驗通過過程控制病毒監測抑制物質去除的有效性，為熟食肉類樣品中提取和濃縮病毒提供方法。HIDA等[19]采用超速離心法使黃瓜和葡萄中鼠諾如病毒-1（Murine Norovirus 1，MNV-1）回收率分別提高2倍和5倍，整個檢測時限小于8 h，獲得了一種更快速的病毒檢測方法。超速離心法不僅富集的病毒純度和質量較好，還具備穩定性好和重復性強的特點。但在離心過程中食品基質中其他成分或碎片會干擾離心效果，采用此方法富集病毒時需考慮病毒粒子的性質，合理設計離心方案，盡量減少反應抑制物帶來的干擾。

3.2.3 蛋白酶K法

蛋白酶K法的原理是通過蛋白酶K在60 ℃作用時破壞病毒粒子的衣殼，將病毒的核酸釋放出來[20]。此方法在國內外檢測標準中普遍應用在貝類消化腺中常見腸道病毒的分離。方法易于操作，并且不含病毒濃縮的步驟，可在幾個小時內完成病毒檢測，適合長期監測[21]。但也有相關研究表明，由于蛋白酶K的活性需依賴熱處理過程，導致此方法在回收病毒過程中有滅活NoV的風險[22]。因此，研究人員在不斷優化貝類腸道病毒分離的方法，以提高病毒檢測靈敏度。例如，楊家樂等[7]和張樂[23]采用蛋白酶K消化法結合PEG沉淀法進行前處理，不僅獲得良好的靈敏度和穩定性，還可節省樣本處理時間，較單獨使用蛋白酶K消化法而言大大提高了NoV的回收率。劉雪杰等[24]采用磷酸鹽緩沖液及蛋白酶K的前處理方法，對福建省市售240份牡蠣和貽貝樣品中的NoV污染情況進行了解，結果NoV陽性率為10.83%，消化腺中病毒含量達3.20×103～7.90× 105copies/g。

3.2.4 超濾濃縮法

超濾濃縮法主要取決于病毒分子量的大小，當液體或小分子質量顆粒低于50～100 kDa濾膜孔徑時便可以將其過濾掉，病毒顆粒則被截留在膜上。作為一種新型病毒富集方法，超濾濃縮方法具有操作簡單、耗時短的特點。此方法現主要應用于瓶裝水NoV病毒的富集過程，食品基質中也有相關研究報道，但由于基質、洗脫過程等步驟的不同，導致富集病毒時檢測結果說法存在差異[25-26]。

3.2.5 直接RNA提取法

直接RNA提取法是采用異硫氰酸胍鹽對食品中RNA分離，再將分離RNA進行純化沉淀的過程。RAJIUDDIN等[27]對直接RNA提取法進行優化，通過增加緩沖液體積，加入果膠酶、植物RNA分離輔助劑和PCR抑制物去除試劑，達到提高NoV回收率和最小化RT-qPCR抑制的目的，優化的直接RNA提取法性能比ISO 15216：2方法中NoV富集方法效果更好，適用于植物源性食品中的病毒分析。但受抑制物的影響，直接RNA提取法雖步驟簡單，但適用范圍比較局限[28]。

3.2.6 免疫磁珠吸附法

免疫磁珠吸附法已成為在復雜基質中用于低拷貝目標病毒顆粒檢測的新型富集方法。此方法主要借助磁珠偶聯的形式，利用抗原與抗體之間特異性反應機制，使NoV特征抗體捕獲目標病毒，從而使樣本中的病毒粒子與雜質分離，達到病毒富集、純化和濃縮的目的[29]。此方法為特異性病毒富集方法，比傳統的非特異性富集方法更有效，不僅操作簡單、快速，還能有效去除樣本中的抑制物質[30]。張樂[23]應用免疫磁珠富集偶聯RT-qPCR的方法，檢測牡蠣中NoV的回收率為15.63%；在此基礎上優化、建立了生物素放大的免疫磁珠富集方法，NoV回收率提高為37.48%；為了降低成本，建立了聚酰胺-胺樹狀分子介導生物素放大的免疫磁珠富集法，優化后NoV回收率高達44.26%，達到了NoV高效富集的目的。免疫磁珠分離法適合于大規模樣本病毒富集工作，如何確保抗體和目的病毒的特異性結合、多抗體組合增加目的病毒類型的捕獲，將是今后研究工作的重點。

3.2.7 免疫濃縮法

組 織 血 型 抗 原（Histo-Blood Group Antigens，HBGAs）是一種復合糖類，NoV的感染與其基因型和人類HBGAs介導的遺傳背景相關[31]。但不同基因型NoV與HBGAs結合的模式不同，據報道已有10種NoV基因型與HBGAs的結合模式被闡明。同時，相關研究表明貝類的消化組織中也存在一種類似HBGAs的物質，并且隨著貝類組織部位的不同HBGAs類型也會不同。免疫濃縮法則是將HBGAs包埋在磁珠上，通過捕獲NoV病毒粒子后再將病毒從磁珠上洗脫下來的過程。張其剛等[32]以青蔥和葡萄為試驗材料，分別采用豬胃黏蛋白偶聯磁珠法（Porcine Gastric Mucin-conjugated Magnetic Beads，PGM-MB）和PEG 8000沉淀法富集NoV，對兩種方法的富集效果進行評價，研究表明應用PGM-MB富集檢測時，NoV回收率和檢測下限均優于PEG沉淀法，同時PGM-MB富集檢測可在4～6 h內完成，方法亦可用于水果蔬菜中NoV的檢測。

4 結語

隨著全球對食源性疾病防范意識的不斷增強，食源性NoV檢測方法的提升及食品基質的監控防控也越來越受到各界人士的重視。但受污染的食物媒介或人與人的接觸沒有預測性，流行病的增長也更是無法預測[35]。其引起食源性NoV疾病暴發的食品污染問題一直存在，并且有研究發現NoV在人體中已存在隱性感染的情況。因此，為保障食品及人身的安全，需從源頭和產業鏈上采取相應的防控措施，包括做好食品原料、加工及運輸等重要環節的管理和監控，開展食源性NoV污染情況調查，建立各種食品媒介風險評估機制和預警方案等，只有在流程和大數據上采用嚴格的監管模式，才能從根本上降低食品媒介感染病毒的風險及控制食源性NoV的暴發。

針對NoV的檢測，國內外標準化的檢測方法也在不斷改善和更新，建立簡便、快捷、準確的食源性病毒檢測方法雖然面臨著巨大的挑戰，但一直是研究者追求并努力的方向。綜合本文所述，現在應用于食源性NoV檢測上的分離方法很多，每種方法均有各自的特點及優缺點，但因樣品狀態不同、基質復雜且病毒低劑量存在等原因，仍舊缺乏能盡可能去除抑制物質并達到快速檢測的方法，對其過程的有效監控、抑制指數的降低和回收效率的提高均需進一步研究和創新，提高方法靈敏度以防止因NoV含量低造成假陰性結果的發生。

如今隨著全球食品產業的多元化和貿易化，食品不僅樣品量大，成分也越來越復雜。例如，調味、高鹽或高糖等產品，在病毒的分離過程中將伴有大量的抑制物產生并去除困難，嚴重影響NoV的提取和檢測，針對這種特殊類別的產品，如何建立高效、適用的病毒分離方法并將其標準化，是人們將要面臨的問題和挑戰。希望通過不同食品類別病毒分離方法的不斷完善和擴充，滿足食源性病毒檢測基質的適用范圍，保證食源性病毒檢測結果的科學、準確，為預防食源性NoV疾病的暴發及食品安全事故的控制打下堅實的基礎。