柳枝稷BiP基因的鑒定、表達分析和抗逆境功能

宋 剛， 方志剛， 王玉龍， 蔡慶生

(1.江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院，江蘇 句容 212400； 2.南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京 210095； 3.喀什大學生命與地理科學學院，新疆 喀什 844099)

內質網(Endoplasmic reticulum，ER)是所有真核生物細胞中蛋白質的分泌場所，其介導了蛋白質合成、折疊和組裝，負責調節新生蛋白質的質量[1]。在ER腔體空間內，由駐留的分子伴侶蛋白執行這些任務和功能，如屬于熱激蛋白70家族(Hsp70)的免疫重鏈綁定蛋白(BiP)。為了維持ER功能的精確性，細胞演化出一種蛋白質監控信號通路——未折疊蛋白應答途徑 (UPR)[2-4]。ER系統在遭受外來脅迫(如高溫、干旱、鹽害等)時，細胞內會積累大量未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，發生ER脅迫，此時細胞會啟動UPR[5]。為恢復體內蛋白質合成的平衡，植物細胞需要通過上調編碼內質網分子伴侶和折疊酶的基因來重建蛋白質折疊能力和需求之間的平衡，BiP即為這些基因之一[6]。類似Hsp70家族中其他同源蛋白，BiP具有2個保守結構域： N端相對分子質量大約44 000的ATP綁定結構域(ABD)，C端相對分子質量大約16 000的多肽綁定結構域(PBD)。PBD結構域負責與未折疊蛋白質底物結合，并受與ABD結構域結合的核苷酸調控[7]。BiP還包括一個C端ER駐留信號(ER retention signals)，功能是使蛋白質留在ER內腔，在植物中其氨基酸序列通常是“HDEL”，在哺乳動物中是“KDEL”[8]。BiP在酵母和哺乳動物中是單個存在的，但在高等植物中是小且高度保守的基因家族并且分散在基因組內，如大豆中含2個[9]，擬南芥[10]、小麥[11]和辣椒[12]中都含有3個，煙草[13]和水稻[14]中則均含有6個。研究結果表明，過表達BiP能增強植物對環境脅迫的耐受性。大豆BiP在煙草[15]和大豆[16]中的過表達，通過防止內源性氧化應激，賦予轉基因植物抗旱性。過表達辣椒CaBiP1的擬南芥轉基因植株自身降低了活性氧積累量，增加了保水性，刺激UPR通路和相關應激基因的表達，提高了對多個環境脅迫的耐受性，包括熱、滲透、鹽和干旱[17]。此外，枸杞LcBiP在煙草中過表達提升了煙草對重金屬Cd的耐受性[18]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)為原產于北美的多年生暖季C4型禾本科植物，根系發達，抗旱能力強，產量高，適合在邊際土地中生長[19-20]。由于低成本和高生物量，尤其纖維素含量高，使其成為理想的生物質能源植物[21]。研究指出，在重金屬污染尤其是Cd污染土地上種植柳枝稷為代表的能源植物可實現生物質資源開發與污染土地利用的雙贏[22]，因此提升柳枝稷對重金屬Cd的耐受性就顯得尤為重要。植物BiP基因在細胞中響應UPR，逆境條件下表現出多樣化功能，可作為柳枝稷提升耐性的候選基因，但關于柳枝稷BiP基因的研究還未見報道。本研究對柳枝稷BiP基因進行鑒定，分析非生物脅迫下BiP基因的表達模式和功能，為柳枝稷分子改良，提升其對重金屬尤其Cd的耐受性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和試驗處理

選取大小一致、均勻飽滿的柳枝稷品種Alamo種子在50%的硫酸中浸泡(搖床振蕩)20 min，用去離子水沖洗干凈，再用70%乙醇溶液浸泡30 min，用去離子水沖洗干凈，播種于盛有去離子水的培養盒水面的塑料濾網上發芽，培養溫度為(25±2) ℃，相對濕度70%，光照每天12 h。待柳枝稷發芽生長至3張幼葉時，將大小一致的健壯幼苗轉移至塑料燒杯中水培，培養條件設置為：溫度30 ℃(日)/20 ℃(夜)，光周期14 h(日)/10 h (夜)。培養過程中每隔1 d調整燒杯的位置，降低邊緣效應[23]。

待植株生長至5張全展葉時用0.1 mmol/L脫落酸(ABA)和15.0 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)噴施處理，以正常生長植株為對照，在噴施處理后0 h、3 h、6 h、12 h和24 h分別采集葉片為樣品。對幼苗分別用 200 mmol/L NaCl、200 g/L聚乙二醇(PEG)、50 μmo/L CdCl2水溶液培養，進行鹽脅迫、干旱滲透脅迫和重金屬Cd脅迫處理，處理后在0 h、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h 6個時間點進行全株采樣[24]。樣品經液氮速凍后存放于-80 ℃用于RNA提取。本試驗每個處理設置3個生物學重復和2個技術重復。

1.2 試驗試劑、菌株和載體

實時熒光定量PCR試劑盒Roche SYBR GREEN Master(ROX)購自羅氏(Roche)公司，T4連接酶、限制性內切酶購自NEB公司，植物基因組DNA提取試劑盒購自原平皓(天津)生物技術有限公司，植物RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自OMEGA公司，其他化學試劑與耗材統一購自南京壽德實驗器材有限公司。

大腸桿菌菌株DH5α、酵母菌株YCF1、G19、HOG1以及入門載體pEND-linker和酵母表達載體pGAD426均由南京農業大學草業學院草坪生理生化實驗室饋贈。

1.3 生物信息學分析

柳枝稷參考基因組數據下載自植物基因組網站Phytozome(http://phytozome.jgi.doe.gov/，PanicumVirgatum_516_ V5.1)，從美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索BiP蛋白并下載序列，將下載序列與柳枝稷蛋白質序列進行本地BLAST比對。比對上的序列通過CDD(Conserved Domain Database)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)檢索是否具有GPR78/BiP/KAR2保守結構域(KOG數據庫編號KOG0100)[25]，如有則為BiP候選序列。再檢查候選序列C端是否含有ER駐留信號序列“HDEL”以確定BiP。使用在線工具PROTPARAM (http://web. expasy.org/protparam/)預測分析BiP蛋白質編碼氨基酸序列大小、相對分子質量、等電點和氨基酸殘基的疏水性。用WOLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)預測蛋白質亞細胞定位，用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白質信號肽位點。多序列比對采用MEGA 7.0完成，通過MEGA 7.0構建多物種系統發育樹(Neighbor-joining method，bootstrap=1 000)。使用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/)網站鑒定 PvBiPs的保守基序(motif)，motif的最大數目設定為10個，motif長度為6～100 個氨基酸，其他參數默認設置。從柳枝稷基因組注釋文件中提取出BiP基因的注釋信息，導入Gene Structure Display Server (GSDS)網站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因的外顯子-內含子結構。提取PvBiPs上游2 kb啟動子序列，使用PlantCARE v1.0 (http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數據庫進行順式作用元件分析。

1.4 植物基因組DNA和總RNA提取、cDNA合成與實時熒光定量PCR

取柳枝稷新鮮植物組織0.1 g，用植物基因組DNA提取試劑盒[原平皓(天津)生物技術有限公司產品]提取gDNA。取柳枝稷幼苗全株樣100 mg并用液氮速凍，使用OMEGA E.Z.N.A.? plant RNA Kit提取植物總RNA。以2 μg總RNA為模板，使用RNA反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。

利用在線引物設計工具(http://www.genscript.com/tools.html#biology)設計擴增引物，引物序列見表1，內參基因使用PvFTSH4[26]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系：2×SYBR Green I Master 10.0 μl、cDNA 2.5 μl、Genen specific primersf(F/R) 2.5 μl，添加ddH2O至20.0 μl。反應程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，熒光信號檢測， 40個循環。試驗在Applied Biosystems 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems,Foster City,CA,USA) 上進行，每個處理設置3次獨立生物學重復和2次技術重復取樣，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

1.5 柳枝稷PvBiP基因克隆、酵母異源表達與抗性分析

根據PvBiP基因編碼序列(Coding sequence，CDS)，設計合成引物(表1)，以gDNA為模板，通過Q5高保真DNA聚合酶擴增獲得目的基因片段，PCR反應體系為：Q5 Reaction buffer 10.0 μl、Q5 GC Enhancer 10.0 μl、dNTPMix 4.0 μl、Template gDNA 4.0 μl、F + R (2.5 μl +2.5 μl)、Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.5 μl，添加ddH2O至50.0 μl 。反應程序為： 98 ℃預變性3 min；98 ℃變性30 s，63 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min，10 ℃，10 min。用E.Z.N.A Gel Extraction Kit-Spin試劑盒回收產物。將雙酶切后的入門載體pEND-linker與PvBiP目的基因片段連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑取陽性克隆進行PCR檢測。選取與目標條帶大小一致的菌液提取質粒，送南京擎科生物科技有限公司測序。

表1 本試驗所用引物序列

提取測序結果正確的陽性克隆質粒，用限制性內切酶PvuⅠ進行線性化處理。將目的片段與表達載體pGAD426進行LR重組反應，轉化大腸桿菌感受態DH5α，挑取陽性克隆，根據載體大小和通過PCR檢測的情況，確定重組反應得到正確的表達載體并提取陽性克隆質粒。制備鹽敏感酵母菌株G19、Cd敏感酵母菌株YCF1和旱敏感酵母菌株△HOG1感受態細胞并加入表達載體pGAD426-PvBiP質粒和pGAD426-GUS對照質粒進行酵母轉化。將轉化后的含PvBiP1a、PvBiP2和PvBiP3的酵母菌株單一克隆在液體培養基中培養至平臺期(OD600=1)，然后使用無菌水將菌液按10倍、100倍和1 000倍梯度稀釋，分別取5 μl菌液按濃度依次點在對照和處理平板上培養，脅迫處理分別使用300 mmol/L NaCl、0.5 mol/L甘露醇和100 μmol/L CdCl2。5～6 d后觀察酵母表型并采集照片。

2 結果與分析

2.1 柳枝稷PvBiP基因的鑒定

在NCBI網站共檢索并下載到23個不同物種(煙草、擬南芥、水稻、玉米、大豆、石榴等)中報道的BiP蛋白序列，與柳枝稷參考基因組數據進行本地BLAST比對，候選序列有多個轉錄本的取1號轉錄本，再經 “KOG0100”結構域和 “HDEL”2個篩選條件，共篩選出4個BiP基因，分別位于柳枝稷基因組chr01K、chr01N、chr05K、chr05N染色體上，蛋白質理化信息及亞細胞定位預測信息見表2。由于Pavir.1KG020800.1和Pavir.1NG010600.1的蛋白質序列、理化參數完全一致，CDS也只有微小差異，因此將它們分別命名為PvBiP1a和PvBiP1b，分別把Pavir.5KG300400.1與Pavir.5NG387200.2命名為PvBiP2和PvBiP3。亞細胞定位預測結果顯示，4個基因均定位在ER，所含信號肽(Signal peptide，SP)分別由23個、25個、23個和27個氨基酸殘基組成。

表2 柳枝稷BiP基因特征和亞細胞定位信息

2.2 柳枝稷PvBiP基因的生物信息學分析

使用水稻[14]、擬南芥[10]、枸杞[18]、大豆[9]、石榴[14]、煙草[14]等BiPs與PvBiPs蛋白構建系統發育進化樹(圖1)。進化樹顯示，PvBiP1a和PvBiP1b聚為一個分支，這與2個基因編碼相同的氨基酸序列相吻合。另外，它們與水稻OsBiP1的進化關系最近。PvBiP2、PvBiP3與水稻OsBiP3、OsBiP4、OsBiP5的遺傳距離較近。

bootstrap=1 000，括號內為GenBank登錄號。圖1 Neighbor-joining法構建的柳枝稷與不同植物BiP 同源蛋白質的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of BiP homologous proteins between different plant species and switchgrass by neighbor-joining method

多物種同源序列比對結果(圖2)顯示，4個PvBiPs與7個同源BiPs的保守結構域domain1～domain5以及5個高度保守氨基酸殘基組成上高度一致，domain 6(HDEL)組成全部一致。 motif分析發現，在4個PvBiPs中10個motif的分布完全相同(圖3a)，domain1 序列“TVIGIDLGTTYSC”是Hsp70家族成員中普遍存在的高度保守序列[27]，位于motif 2 N端，為β-磷酸化結合功能區。Domain 2序列對應motif 4 N端，為γ-磷酸化結合功能區，domain 3(腺苷酸結合功能區)位于motif 3 N端，domain 4(鈣調素蛋白結合功能區)位于motif 5 N端[25]。C端5個高度保守的氨基酸殘基，能促進與多肽底物氫鍵的結合[5-6]，還有重要的α或β多肽底物結合基序domain 5(位于motif 7和motif 9)，能確保初始多肽底物不從結合位置脫落釋放[11]。綜上，PvBiPs具有BiP結構域且高度保守。

方框表示所對應domain的氨基酸序列范圍，箭頭所指為高度保守氨基酸殘基。圖2 柳枝稷BiP與擬南芥、水稻和枸杞中同源蛋白多序列比對Fig.2 Multiple alignment of the BiP of switchgrass with BiP homologous proteins of Arabidopsis, rice and Lycium chinense

基因結構(圖3b)顯示，PvBiP1a、PvBiP1b具有7個內含子，PvBiP2、PvBiP3沒有內含子。PvBiPs上游2 kb啟動子序列分析結果(表3)顯示,它主要包括響應非生物脅迫相關和激素應答2類順式作用元件，這些元件包括：響應低溫脅迫的 LTR 元件、響應干旱脅迫的MBS元件、與機械損傷有關的 WUN-motif元件、植物響應脅迫和防御的TC-rich repeats元件、響應脫落酸作用的ABRE元件、參與厭氧誘導調節的ARE元件、與缺氧特異性誘導有關的增強因子GC-motif元件、響應生長素的TGA-element元件、參與水楊酸反應的TCA-element元件、參與赤霉素響應調節的TATC-box元件、參與生長素響應調節的AuxRR-core元件、參與茉莉酸甲酯響應調節的CGTCA-motif元件和TGACG-motif元件。

CDS:編碼序列；UTR：非翻譯區；Intron:內含子。圖3 柳枝稷BiP基因保守基序分布(a)和基因結構(b)Fig.3 Distribution of conserved motifs (a) and gene structure (b)of BiPs in switchgrass

表3 柳枝稷BiP基因啟動子區脅迫和激素相關順式作用元件

2.3 非生物脅迫對柳枝稷BiP基因表達的影響

二硫蘇糖醇(DTT)是一種內質網誘導劑，能引起被處理對象發生內質網脅迫而激發UPR[28]。通過qPCR檢測柳枝稷幼苗經15 mmol/L DTT 噴施處理后0～24 hPvBiPs的相對表達量，結果(圖4)表明，PvBiPs相對表達量總體呈現先下降后上升然后又下降的趨勢，到24 h時降至接近0 h的水平。各基因對DTT的響應存在差異，PvBiP1a與PvBiP1b的相對表達量峰值出現在12 h，PvBiP2、PvBiP3的相對表達量在3 h達到峰值，且與PvBiP1a、PvBiP1b的相對表達量相比更高，最高的是PvBiP2。

圖4 二硫蘇糖醇(DTT)誘導內質網脅迫下柳枝稷BiP基因的表達Fig.4 Expression of BiPs in switchgrass under endoplasmic reticulum stress induced by dithiothreitol (DTT)

用NaCl、PEG、ABA和CdCl2處理柳枝稷幼苗24 h，不同時間點PvBiPs相對表達量的變化如圖5所示?？傮w上PvBiPs的相對表達量是先上調后下降的趨勢。NaCl脅迫下，各基因相對表達量峰值基本出現在12 h。PEG滲透脅迫下，PvBiP1a相對表達量峰值出現在6 h，比0 h處理上調6.2倍，PvBiP1b相對表達量上調5.6倍；PvBiP2相對表達量峰值表現在3 h，上調4.0倍，PvBiP3相對表達量峰值在12 h，上調4.7倍。ABA處理下，PvBiP2相對表達量的峰值在12 h ，上調9.0倍，明顯高于其他基因。CdCl2處理下，PvBiP2相對表達量峰值仍然出現在處理12 h，上調9.0倍，PvBiP3相對表達量的峰值在6 h，達到8.0倍。

圖5 NaCl、ABA、PEG和CdCl2脅迫處理下柳枝稷BiP基因的表達Fig.5 Expression of BiPs in switchgrass under NaCl stress, ABA stress, PEG stress and CdCl2 stress treatments

2.4 柳枝稷BiP基因克隆與酵母功能驗證

通過PCR擴增得到PvBiP1a、PvBiP2和PvBiP3全長，擴增產物見圖6。

M:DL5 000 DNA Marker。圖6 PCR擴增的PvBiP1、PvBiP2、PvBiP3基因的產物條帶Fig.6 Amplified product strips of PvBiP1, PvBiP2 and PvBiP3 genes amplified by PCR

將擴增的PvBiP1(實際按PvBiP1a擴增)、PvBiP2和PvBiP3產物經同源重組分別連接到pGAD426酵母表達載體上 ，轉化酵母菌株。在100 μmol/L CdCl2SD/-Ura選擇培養基平板上，與對照pGAD426-GUS菌株比較，PvBiP1a、PvBiP2和PvBiP3過表達酵母菌株的生長顯著增強(圖7a)，呈現出一定的耐Cd表型。在300 mmol/L NaCl SD/-Ura-His平板上，3個基因相比于對照鹽脅迫表現出明顯耐性，尤其PvBiP1a和PvBiP2的耐鹽表型更明顯(圖7b)。而0.5 mol/L甘露醇脅迫處理表型與對照間沒有明顯差異(圖7c)，說明柳枝稷BiP基因可能對甘露醇模擬干旱脅迫響應敏感。上述結果表明，酵母過表達PvBiPs后具有耐鹽和耐Cd脅迫的能力，但對滲透干旱脅迫較敏感，與對照表型基本一致。

a：CdCl2脅迫；b：NaCl脅迫；c：甘露醇脅迫。YCF1/pGAD426-GUS為空白對照Cd敏感酵母菌株，G19/pGAD426-GUS為空白對照鹽敏感酵母菌株、△HOG1/pGAD426-GUS為空白對照干旱敏感酵母菌株，其余為相應處理轉基因酵母菌株。圖7 柳枝稷BiP基因在非生物脅迫下的酵母功能驗證Fig.7 Yeast function verification of BiPs in switchgrass under abiotic stresses

3 討 論

四倍體柳枝稷具有2套亞基因組K和N，據推測它們來自1.00×106年前同源四倍體化事件的2個近親祖先[29-30]。本研究在柳枝稷基因組中共鑒定了4個BiP基因，分布在chr01K、chr01N和chr05K、chr05N 2對同源染色體上。序列比對結果表明,它們彼此相似度很高，尤其PvBiP1a和PvBiP1b編碼的氨基酸序列完全一致，可能是基因復制形成。柳枝稷BiPs和其他物種BiP序列高度相似，體現在具有相同保守結構域，如domain 4是鈣調素結合基序，能與Ca2+結合蛋白質起作用，調節N端ATP酶活性[11]，使ATP水解產能驅動BiP在新生蛋白質組裝過程中結合未折疊或錯誤折疊的多肽底物[31]。另一必需腺苷結合功能域domain 3(motif 3 N端)和C端5個氫鍵結合氨基酸位點(V-T-Y-Q-S)則高度一致。基因內含子結構有3種模式：無內含子、1個內含子、超過1個內含子[32]，研究結果證明，內含子通過外顯子重組驅動進化[33]，對于含多個內含子的基因，通過可變剪接實現單個基因的多個蛋白質翻譯，對基因功能具有重要影響[34-35]。如辣椒CaBiP1、CaBiP2有7個內含子，CaBiP3有6個內含子，CaBiP3的整體表達水平遠遠低于CaBiP1、CaBiP2，在鹽和高溫脅迫下，CaBiP3受誘導，表達量顯著高于CaBiP1、CaBiP2[17]。柳枝稷PvBiP1a、PvBiP1b內含子為7個，PvBiP2、PvBiP3無內含子，暗示它們可能存在功能分化上的差別。

研究結果表明，植物BiPs表達受組織特異性和生長發育調節[17,25,36]。分析數據庫(https://switchgrassgenomics.noble.org)中柳枝稷RNA-seq表達量數據發現，PvBiP2在授粉后形成種子階段的表達量要明顯高于其他組織或發育階段，這與小麥TaBiP在種子中高表達、在莖葉器官中低表達[11]的結果相近，PvBiP2可能在種子發育過程中扮演重要的調控角色?；騿幼臃治霭l現，PvBiPs中普遍存在響應干旱脅迫的作用元件 MBS、脫落酸作用反應元件ABRE、茉莉酸甲酯作用元件TGACG-motif，低溫響應元件LTR、機械損傷響應元件wun-motif只在PvBiP2、PvBiP3中檢測到，順式作用元件的差異預示PvBiPs面對非生物脅迫時會有不同響應。在DTT與NaCl、PEG、ABA、CdCl2處理下，PvBiP基因均表現為隨脅迫時間先上調表達后逐漸下降至本底表達水平的變化趨勢。PvBiP1a和PvBiP1b由于蛋白質序列完全一致，其相對表達量變化趨勢和峰值大小也基本一致。盡管PvBiP2與PvBiP3的變化趨勢類似，但峰值大小存在差異。PvBiP2在DTT、NaCl、ABA和CdCl2脅迫處理下表達峰值都是最高的，PvBiP1a和PvBiP1b僅在PEG滲透脅迫下表現出高于PvBiP2、PvBiP3的上調表達量。非生物脅迫下BiP基因表達量的差異，涉及脅迫信號傳導復雜的調節網絡，反映了轉錄水平和蛋白質合成水平的不同。由于BiP不僅能體現響應UPR的分子伴侶活性，還可以作為內質網脅迫調節因子起到調節作用[37-38]，所以上調表達最高的PvBiP2可能是BiPs中主要的脅迫調節因子。進一步在酵母中異源過表達3個PvBiP基因(PvBiP1a與PvBiP1b編碼的蛋白質序列一致，只研究PvBiP1a)，結果顯示，PvBiP基因有耐Cd和耐鹽表型，對滲透脅迫敏感。在PvBiP基因中，PvBiP2在CdCl2脅迫下(1～12 h)持續上調表達，表達量也最高，其耐鎘調控作用值得進一步研究。

4 結 論

本研究在柳枝稷基因組中共鑒定了4個定位于內質網的BiP基因，命名為PvBiP1a、PvBiP1b、PvBiP2、PvBiP3，分別位于柳枝稷的1號和5號染色體上。多物種序列比對和進化分析結果表明，PvBiPs具有BiP蛋白典型功能結構域，PvBiPs啟動子序列主要包括脅迫防御和激素應答順式作用元件。PvBiPs受DTT誘導表達，在NaCl、PEG、ABA和CdCl2脅迫下都上調表達，其中PvBiP2的相對表達量峰值較高。酵母異源轉化耐逆功能驗證結果顯示，PvBiPs對鎘和鹽脅迫有耐性表型，對甘露醇滲透脅迫較敏感。PvBiP2可作為鎘脅迫響應基因進行深入研究。