不同抗菌檢測方法對四種藥物抗菌效果評判的影響

李福元 ，陳光玉 ，王秀敏 ，王海良 ，溫天乙

（1.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102609；2.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心，北京 102609；3.北京市獸藥飼料監(jiān)測中心，北京 102609）

抗菌藥物的抗菌效果檢測結(jié)果是臨床應(yīng)用的重要依據(jù)，常用的檢測方法有擴散法、稀釋法、菌落計數(shù)法、MTT比色法以及營養(yǎng)物質(zhì)消耗法等[1-2]。獸醫(yī)臨床中常用的是擴散法和稀釋法。其中，擴散法包括藥敏片法、杯碟法等[3]；稀釋法包括肉湯稀釋法、微量稀釋法等。對同一種藥物使用不同檢測方法，其評判結(jié)果也會出現(xiàn)差異。例如，采用杯碟法所產(chǎn)生的抑菌圈的邊緣藥物濃度無法得知，所以無法將抗菌效果和動物體內(nèi)血藥濃度聯(lián)系起來，也無法準(zhǔn)確給出臨床藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙門菌，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氨芐青霉素鈉，來自華北制藥集團制劑有限公司；阿莫西林鈉，來自上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸土霉素，來自上海麥克林生化科技有限公司；香連溶液，來自愛迪森（北京）生物科技有限公司；普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，來自北京中海生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

雙人單面凈化工作臺（SWCJ-2FD），恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272），電子天平（BX820S），立式高壓蒸汽滅菌器（LDZX-30KBS），移液槍。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥物配制。取氨芐青霉素鈉、阿莫西林鈉、鹽酸土霉素各0.1 g，分別加入無菌生理鹽水定容至100 mL，配制成1 000 μg/mL的溶液，待用。取12.5 g香連溶液原液，加入無菌生理鹽水定容到100 mL，配制成125 mg/mL的溶液，待用。

1.3.2 用稀釋法測定最小抑菌濃度。取滅菌具塞試管10支，編號后排列于試管架上。于每支試管中加入5 mL滅菌生理鹽水。于第1支試管中加入5 mL供試藥品原液，混合均勻，取5 mL加入第2支試管中，振搖混合均勻后，取5 mL加入第3個試管中，依此類推，直至稀釋到第8個試管。將第8支試管中的液體混合均勻后，取出5 mL棄去。在稀釋好的藥液中分別加入5 mL普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（2×）。按照此稀釋方法得到的氨芐青霉素鈉、阿莫西林鈉、鹽酸土霉素的濃度分別 為 250.00、125.00、62.50、31.25、15.62、7.81、3.91 和1.95 μg/mL； 香連溶液的濃度分別為 31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 和 0.24 mg/mL。 在以上各組中加入20 μL沙門菌菌液。第9支試管為陽性組，加入5 mL滅菌生理鹽水、5 mL普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（2×）和 20 μL供試菌懸液。第 10支試管為陰性組，加入5 mL滅菌生理鹽水、5 mL普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（2×），不加菌液。將各試管置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，以陽性組出現(xiàn)渾濁而陰性對照組無菌生長時為培養(yǎng)結(jié)束時間點。觀察各試驗組，以試管澄清的最低稀釋濃度為該樣品的最小抑菌濃度[4-5]。

1.3.3 用杯碟法測定抗菌效果。按說明書配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20 min，待溫度降至50～60℃時，傾入無菌平皿，使瓊脂厚度達(dá)4～5 mm，凝固后待用[6]。

取沙門菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落，接種于普通肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。用營養(yǎng)肉湯進(jìn)行活化菌液的10倍遞增稀釋。取各稀釋度菌液100 μL涂布于相應(yīng)的瓊脂平板上，各稀釋濃度做3個重復(fù)。37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長狀況，以確定各菌的最佳涂布濃度。

無菌操作取合適濃度的供試菌液100 μL滴于培養(yǎng)基表面，用涂布棒將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面。將滅菌的牛津杯放置在每個平皿培養(yǎng)基上，注入同體積藥液，靜置30 min后37℃培養(yǎng)18～24 h，用游標(biāo)卡尺測量藥物的抑菌環(huán)直徑，同時做平行對照，取平均值[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度檢測

由表1可知，氨芐青霉素鈉對沙門菌的MIC為3.91 μg/mL，阿莫西林鈉對沙門菌的MIC也為3.91 μg/mL，鹽酸土霉素對沙門菌的MIC為7.81 μg/mL。由表2可知，香連溶液對沙門菌的MIC為1.95 mg/mL。

表1 最小抑菌濃度測定結(jié)果（μg/mL）

表2 最小抑菌濃度測定結(jié)果（mg/mL）

2.2 杯碟法檢測

由表3可知，氨芐青霉素鈉對沙門菌的MIC處于 3.91 μg/mL 時抑菌圈直徑為（17.0±0.9）mm，阿莫西林鈉對沙門菌的MIC處于3.91 μg/mL時抑菌圈直徑為（21.0±1.1)mm，鹽酸土霉素對沙門菌的MIC處于 7.81 μg/mL時抑菌圈直徑為(18.4±0.8)mm。由表4可知，香連溶液對沙門菌的MIC處于1.95 mg/mL時抑菌圈直徑為(6.5±0.2)mm。

表3 3種抗生素各濃度抑菌圈直徑（mm）

表4 香連溶液各濃度抑菌圈直徑（mm）

3 討論

對病原菌藥物敏感性的檢測在指導(dǎo)臨床用藥方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。抑菌圈的大小對評價藥物的抗菌效果具有直接意義。但本試驗表明，出現(xiàn)抑菌圈的藥物濃度并不一定大于藥物的最小抑菌濃度。氨芐青霉素鈉對沙門菌的MIC為3.91 μg/mL時，抑菌圈為（17.0±0.9）mm，抑菌圈小于(17.0±0.9)mm 的藥物濃度，使用倍比稀釋法檢測不到完全抑菌效果；阿莫西林鈉對沙門菌的MIC為3.91 μg/mL，此濃度下的抑菌圈直徑為(21.0±1.1)mm，抑菌圈小于(21.0±1.1)mm 的藥物濃度，使用倍比稀釋法檢測不到完全抑菌效果；鹽酸土霉素對沙門菌的MIC為7.81 μg/mL，此濃度下抑菌圈直徑為(18.4±0.8)mm，抑菌圈小于(18.4±0.8)mm的藥物濃度，使用倍比稀釋法檢測不到完全抑菌效果；香連溶液對沙門菌的MIC為1.95 mg/mL，此濃度下的抑菌圈直徑為(6.5±0.2)mm，抑菌圈小于(6.5±0.2)mm的藥物濃度，使用倍比稀釋法檢測不到完全抑菌效果。通過以上結(jié)果得出，藥液出現(xiàn)抑菌圈的濃度并不一定大于最小抑菌濃度，當(dāng)抑菌圈小于最小抑菌濃度所對應(yīng)的抑菌直徑時，有可能達(dá)不到完全抑菌效果。所以臨床評價抗菌藥物的效果時，使用杯碟法等方法得出的評價結(jié)果并不一定是準(zhǔn)確的。推測其原因可能是在檢測時，藥液處在37℃的環(huán)境中，在擴散過程有溶劑蒸發(fā)，由此造成藥液的局部濃度升高從而出現(xiàn)抑菌圈。