子宮內電穿孔法調控鼠胚大腦皮質神經干細胞基因表達體系的建立

歐偉明 何龍楷 王曉鈺 楊雪松 王廣 李冰肖 金雅 韓莎莎 柳國勝

（1.暨南大學附屬第一醫院新生兒科，廣東廣州 510632；2.暨南大學醫學院組織與胚胎學系，廣東廣州 510632）

大腦皮質的發育是神經干細胞（neural stem cell，NSC）分化發育和成熟的過程［1-2］。NSC不斷進行增殖和凋亡，非對稱性分裂而來的子細胞在特定部位分化為具有層特異性表型的神經元并逐漸成熟，最終形成大腦皮質的各層神經元，這些不同層次的神經元擁有各自獨特的形態特征和電生理特性，共同維系著大腦皮質的正常結構和功能［3-5］。

動物模型體內靶向調控大腦皮質NSC 基因表達是研究基因對大腦皮質發育影響的重要方法，目前體內調控基因表達主要有以下幾種方法：模式動物構建、腺相關病毒外源基因導入和子宮內電穿孔（in uteroelectroporation，IUE）技術等［6］。由于部分基因改變可導致胚胎死亡，因此無法進行模式動物構建，而腺相關病毒外源基因導入需要至少2周的時間才可穩定表達載體蛋白，因而不適用于部分胚胎發育學的研究。IUE技術是一種利用電穿孔技術注射DNA 質粒，將基因引入子宮內胚胎特定位置以便靶向調控目的基因表達的技術。IUE 技術誕生于20 世紀80 年代，是體內研究胚胎神經發育與基因功能的一種重要手段，通過調整電極的結構和方向，可以轉染腦組織不同部位的神經元（如大腦皮質、海馬、腦干和小腦等），具有時間和空間的可調控性［7］。

在進行大腦皮質發育相關研究時，可利用IUE技術將質粒DNA 導入鼠胚側腦室，電脈沖在細胞膜上產生瞬時孔隙，使質粒DNA 進入大腦皮質NSC，從而靶向調控發育中的鼠胚大腦皮質區域的基因表達，可用于NSC 的增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和神經元成熟等體內研究［8］，對神經發生的研究具有重要價值。與其他體內靶向調控基因表達技術相比，IUE技術靶向調控大腦皮質NSC 基因表達的優勢還在于，質粒DNA 導入胚胎側腦室24 h 后即可在NSC 穩定表達載體蛋白，從而迅速觀察到靶基因對NSC分化發育的影響［6］。

盡管利用IUE技術進行鼠胚大腦皮質發育的研究在國外已得到應用，但國內目前對該技術的應用尚處于探索階段。本研究詳細闡述如何利用IUE技術觀察大腦皮質NSC 的增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和神經元成熟，以期為國內學者深入開展大腦皮質神經發生的相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡C57BL/6J小鼠購于北京華阜康生物科技有限公司［SCXK（京）-2019-0008］，動物飼養于暨南大學實驗動物中心［SYXK （粵） -2017-0174］。雄性小鼠1只，雌性小鼠7只，將2~3只雌性小鼠和1只雄性小鼠在同一籠里合籠過夜，次日早上檢查陰道精栓（陰道精栓呈淡黃色）觀察到陰道精栓的當天即定義為孕0.5 d。所有操作均符合實驗動物倫理學要求（IACUC-20210807-03）。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：ECM399胚胎電轉儀（BTX，美國）。試劑：綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP，ab13970，1∶1 000）、性別決定基因相關轉錄 因 子 2 （SRY-related HMG box-containing transcription factor-2，Sox2，ab97959，1∶200）、T型盒結構域神經元蛋白2（T-box brain protein 2，Tbr2，ab23345，1∶100）、染色質重塑復合物亞基蛋 白2 （chromatin remodeling complex subunit，Ctip2，ab18465，1∶200）、熒光二抗（1∶500）抗體均購自美國Abcam公司，多同源復合物蛋白3（polyhomeotic homolog 3，pH3，1∶400，9713）、剪切半胱天冬酶3（cleaved caspase-3，CC3，9661，1∶200）抗體均購自Cell Signaling Technology公司，4', 6- 二 脒 基-2- 苯 基 吲 哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，1∶1 000，C1002，上海碧云天生物技術有限公司，中國），質粒去內毒素中提試劑盒（9783S，寶日醫生物技術有限公司，中國），pCIG質粒（P24992，武漢淼靈生物科技有限公司，中國）。

1.3 IUE實驗

（1）麻醉、備皮、消毒、鋪巾：稱量孕14.5 d孕鼠體重，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg，將孕鼠放置在37℃恒溫加熱板上，在以臍為中心約4 cm×4 cm方形區域上進行術前脫毛備皮，使用碘伏消毒手術區域3 次，在手術區域放置無菌手術單，完全覆蓋孕鼠。（2）暴露子宮：用剪刀在腹部切開約2 cm 手術切口，在切口周圍放置無菌紗布，并用加熱至37℃的0.9%氯化鈉溶液濕潤紗布，用鑷子暴露出子宮，將子宮放置在紗布上（圖1A）。（3）側腦室內質粒注射：輕柔地用左手拇指和食指穩定胚胎（胚胎在羊膜袋中是可移動旋轉的，調整合適的位置以準確地注射質粒至腦室內，在操作時注意不要損壞胎盤和血管，這對胚胎后續的存活非常重要）。在胚胎眼球上方約2 mm處可見透明側腦室，用微毛細玻璃管，輕輕戳入側腦室，術者會有2次輕微的落空感（對應于毛細玻璃管穿過子宮，然后穿過胚胎的皮膚和顱骨），使用嘴式顯微注射管注入0.2~0.3 μL 混綠色染料（固綠）的質粒DNA 至胚胎側腦室中，若側腦室由透明變為綠色則說明注射成功（圖1B），質粒濃度范圍為1 μg/μL（單一質粒）至2 μg/μL（混合質粒）。（4）電轉：將ECM399胚胎電轉儀電極夾的正極放在質粒注射側，將負極放在胚胎頭的另一側，然后按下電擊按鈕，直至電穿孔完全結束（圖1C）。在電穿孔過程中可見胚胎的輕微收縮運動。電轉條件為：電壓40 V，脈沖5 次［7，9-10］；當一側的所有胚胎都被電轉后，小心將子宮放回腹腔內，開始電轉另一側。（5）術后縫合及觀察：胚胎電轉結束后進行手術切口縫合，將孕鼠放回鼠籠里。鼠籠下放置37℃恒溫加熱墊保證手術后孕鼠的體溫恒定，手術后15 min，孕鼠應在鼠籠中自發活動。本實驗取7 只孕鼠，每只孕鼠電轉2~4 個胚胎，設為電轉組，余下未進行電轉操作的胚胎作為對照組。

圖1 子宮內電穿孔操作示意圖

1.4 腦組織切片制備和免疫熒光染色

鼠胚電轉后于孕16.5 d 或孕17.5 d 取出胚胎并分離出鼠腦，于4%多聚甲醛過夜固定后，放置于30%蔗糖溶液中4℃保存。約24 h后可見組織塊沉于30%蔗糖溶液底部。將組織塊移入包埋盒，填充包埋劑，放置于-80℃冰箱長期保存。使用冰凍病理切片機，切成厚度為15~30μm 的冰凍切片。選擇目的切片后，冰凍切片取出浸泡于PBS中洗3次，每次5 min。用封閉液室溫封閉60 min，棄去封閉液，滴加用封閉液稀釋的相應一抗，濕盒中4℃孵育36 h。浸泡于磷酸鹽緩沖液中洗3 次，每次5 min，滴加熒光二抗和DAPI，室溫避光孵育3 h，結束后清洗3 次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑并用蓋玻片封片。熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。采用Fiji軟件統計免疫染色陽性細胞的數量、形態和熒光表達強弱等。

1.5 統計學分析

采用SPSS 25.0統計軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IUE實驗對小鼠胚胎生長發育的影響

電轉組胚胎的存活率約為90%，胚胎重為（0.874±0.024）g，頭重為（0.293±0.007）g，與對照組相比差異均無統計學意義（P>0.05），提示IUE實驗不影響胚胎生長發育（表1）。

表1 2組胚胎存活率和體格發育情況比較

2.2 大腦皮質NSC的增殖、凋亡、分裂和定向分化情況

本研究對孕14.5 d孕鼠胚胎大腦皮質NSC電轉pCIG 質粒，pCIG 質粒表達重組增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）。孕16.5 d取材切片觀察腦室區NSC的增殖、凋亡、分裂和定向分化的情況。pH3標記處于有絲分裂期的細胞，用pH3（紅色）和EGFP（綠色）進行雙標可觀察調控目的基因后對NSC 增殖的影響，若兩者共標細胞數量明顯增多或減少，則提示電轉調控的目的基因與NSC 的增殖功能相關（圖2A）。CC3 為細胞凋亡的標記物，用CC3（紅色）和EGFP（綠色）進行雙標可觀察目的基因后對NSC凋亡的影響，若兩者共標細胞數量明顯增多或減少，則提示電轉調控的目的基因與NSC 的凋亡功能相關（圖2B）。在大腦皮質發育過程中，腦室區的NSC不斷向外分化遷移，Sox2是NSC的標記物，Tbr2 陽性細胞是由Sox2 標記的NSC 分化而來的中間前體神經元，用Tbr2（紅色）和EGFP（綠色）進行雙標，可觀察調控目的基因后NSC 分化成為中間前體神經元數量的變化（圖2C）。用Sox2（紅色）和EGFP（綠色）進行雙標，可觀察調控目的基因后停留在NSC 階段未分化的細胞數量變化（圖2D），結合Tbr2 和Sox2 陽性細胞的統計結果，可觀察調控目的基因后對NSC定向分化的影響。γ-Tublin標記細胞的中心體，當細胞進入有絲分裂后期，中心體一分為二，分別牽引著紡錘絲和染色質，通過測量兩個中心體之間的夾角可判斷該細胞是在進行對稱性分裂還是非對稱性分裂［11-12］，若該角度大于60°而小于等于90°，則定義為對稱性分裂，若該角度大于0°而小于等于60°，則定義為非對稱性分裂。對稱性分裂可產生2 個相同的NSC從而擴大神經祖細胞池；而非對稱性分裂可產生1 個NSC 和1 個子代細胞（可為中間前體細胞、Ⅴ~Ⅵ層內層神經元或Ⅱ~Ⅳ層外層神經元）。通過統計分析其角度，從而明確NSC 自我更新和分化的比例（圖2E~F）。放射狀膠質細胞（radial glial cell，RGC）是在大腦皮質發育過程中最主要的NSC，典型的RGC 呈現出放射軸形態，底部的胞體與腦室表面連接，向上伸出長長的放射軸，當RGC 發育異常時，與腦室表面連接的胞體形態會出現紊亂和脫離，放射軸的末端“尾足”分支會增多。本研究中，孕16.5 d取材切片后在腦室區可觀察到呈典型放射軸形態的RGC（圖2G），在皮質板區域可觀察RGC 放射軸尾足的結構（圖2H），從而進一步研究目的基因對RGC 形態和功能的影響。

圖2 大腦皮質NSC的增殖、凋亡、分裂和定向分化情況

2.3 大腦皮質NSC的遷移和成熟情況

大腦皮質的NSC 首先從腦室區分裂產生，在胚胎發育的過程中，經過遷移區向外分化遷移，最終在大腦皮質表面皮質板區域形成成熟的神經元。孕17.5 d 取材切片后，可見EGFP 陽性細胞存在于腦室區，此處細胞為未分化的NSC 和中間前體神經元；遷移區的細胞為正在遷移的神經元；皮質板區域的細胞為成熟的神經元（圖3A）。可通過統計EGFP陽性細胞在各個分區所占的百分率來明確NSC 遷移的情況。在大腦皮質發育中，先形成Ⅴ~Ⅵ層神經元，后形成Ⅱ~Ⅳ層神經元。Ctip2（紅色）是大腦皮質Ⅴ~Ⅵ層的標記物，孕17.5 d已初步發育完全，可通過與EGFP雙標來觀察NSC向大腦皮質Ⅴ~Ⅵ層發育的情況（圖3B）。正在遷移的神經元形態呈雙極神經元形態，下端膨大部分為胞體，上端細長部分為樹突，以胞體為中心測量其遠端樹突的長度可確定遷移神經元發育的情況（圖3C~E）。神經元的成熟包括樹突、樹突棘和突觸形成等，孕17.5 d 皮質神經元樹突已初步形成，在大腦皮質板區域可見大量發育成熟的神經元，通過測量神經元樹突分支的密度、長度和胞體的面積，確定神經元成熟的情況（圖3F~G）。

圖3 大腦皮質NSC 的遷移和成熟情況

3 討論

IUE實驗技術具有高效、操作簡單、可重復性強、費用低及胚胎發育研究適用范圍廣等優勢［3］。IUE技術過程中胚胎的存活率高，質粒轉染成功率高，Baumgart 等［13］研究發現IUE 電轉后胚胎的存活率和轉染成功率均大于90%，本實驗結果與之一致。同時我們發現電轉組胚胎重、頭重指標與對照組胚胎相比差異無統計學意義。Comer 等［14］研究發現，IUE電轉胎鼠出生后正常生長，可進行胚胎期調控大腦皮質基因表達對小鼠行為學影響的相關研究。以上研究說明IUE實驗技術并不影響胚胎體格發育，是目前研究胚胎期大腦皮質發育學與功能學的最佳實驗手段。

鼠胚神經發生的高峰期是孕12.5~18.5 d，期間NSC神經發育相關基因大量表達，在此時間段調控大腦皮質NSC 靶基因的表達，可對大腦皮質發育過程中靶基因功能進行充分研究。電轉時間點可結合研究目的和可操作性來進行選擇，一般選擇孕12.5~15.5 d 進行［9］，但孕12.5 d 和孕13.5 d 鼠胚腦室結構不清，肉眼下電轉操作難度較大且鼠胚死亡率較高，從孕14.5 d開始鼠胚腦室結構清晰可見，電轉后鼠胚存活率高。孕12.5~16.5 d 是NSC向中間前體神經元大量分化的時期；孕14.5~18.5 d是NSC 向皮質神經元分化遷移的高峰時期；孕16.5~18.5 d是神經元樹突和突觸早期發育的重要時期，本研究選擇孕14.5 d電轉既能保證胚胎的存活率和電轉成功率，又能通過在電轉后不同時間點取材，完整地觀察到NSC 增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和成熟的發育過程［15］，因此孕14.5 d也是國外研究選擇較多的電轉時間點［9，16］。

大腦皮質正常的分層結構和完整的神經通路對認知、行為、運動、感覺和意識整合等高級功能至關重要，胚胎時期大腦皮質的正常發育是保證生后大腦正常生理功能的結構基礎。研究發現，大腦皮質發育過程中NSC 的增殖、凋亡、定向分化、遷移和成熟等發生異常均會導致后代大腦皮質結構和功能出現障礙［17-18］。目前，利用IUE技術對NSC 的增殖、凋亡、定向分化、遷移和成熟等進行胚胎大腦皮質發育研究的方法在國外已成熟開展：László等［19］通過IUE技術調控遷移α/β神經元水解酶結構域蛋白4 （alpha/beta-hydrolase domain-containing 4，Abhd4）的表達，發現Abhd4促進大腦皮質遷移神經元的凋亡；Da Silva等［20］研究利用IUE 技術與細胞周期標志物EdU 和BrdU 進行雙標發現當Wnt信號通路缺失時會導致大腦皮質NSC增殖減少、細胞周期延長，進一步利用IUE技術上調Wnt信號通路能夠逆轉上述表型，從而揭示了Wnt信號通路在NSC增殖和細胞周期中的分子機制；Geng 等［21］研究利用IUE 技術結合實時錄像細胞工作站發現NSC 在缺失有絲分裂樣蛋白2（mtotic kinesin-like protein 2，Kif20a）時出現定向分化異常，缺失Kif20a促進NSC分化成為中間前體神經元，NSC細胞數量減少，分化成為成熟神經元的數量也隨之減少，最終導致皮質變薄；Nakagawa 等［22］通過IUE 技術聯合啟動子驅動質粒調控大腦皮質RGC 細胞運動介質蛋白1（mediator of cell motility 1，Memo1）的表達，發現Memo1基因敲除后RGC 細胞的放射軸結構紊亂，從而抑制NSC遷移；IUE技術也大量運用于神經元成熟的研究中，Zhong等［23］通過IUE技術調控神經元mTOR信號通路的表達，觀察電轉后神經元樹突、興奮性和抑制性突觸等結構，發現突觸上γ-氨基丁酸受體的形成依賴于mTOR信號通路。可見，國外學者已利用IUE技術在胚胎NSC和大腦皮質發育相關研究方面取得重要進展，但目前國內對于IUE技術尚處于提高成功率［24］和轉染效率［25］的探索階段。

除本研究中所涉及的大腦皮質NSC 增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和成熟等研究外，利用IUE技術在胚胎腦室內轉染目的基因后，還可結合啟動子驅動表達質粒、時差顯微鏡和腦片培養等技術，進行NSC 行為追蹤等多種胚胎神經發生相關研究［6］。

綜上所述，利用IUE技術在胚胎腦室內轉染目的基因，可進行大腦皮質NSC 的增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和成熟等神經發育相關研究，IUE技術調控小鼠胚胎大腦皮質NSC基因表達體系的建立，能對深入研究大腦皮質發育相關基因的生理功能和致病機制具有重要的方法學意義。