利用外顯子測序在高度近視家系中鑒定一個新的NYX基因錯義突變

劉書言，鄧妮妮，陳金卯，田 奇，彭鳳蘭

（1. 廣西醫科大學基礎醫學院，南寧 530021；2. 玉林愛爾眼科醫院，玉林 537000；3. 廣西醫科大學第一附屬醫院眼科，南寧 530021；4. 中南大學生命科學學院醫學遺傳學研究中心，長沙 410008；5. 長沙衛生職業學院基礎醫學部，長沙 410205）

近視主要表現為屈光不正以及眼軸延長，占全球視力損傷患者總數的48.7%［1-2］，是最常見的人類眼部疾病之一。從世界范圍看，美國和歐洲人群中近視發生率在20%～30%，而亞洲人群中近視的發生率高達70%［3-7］。高度近視也稱病理性近視，主要是指近視度數小于或等于-6.00 m-1或眼軸長度超過26 mm的屈光不正，且伴有進行性眼軸延長，眼底視網膜和脈絡膜呈萎縮性退行性病變［8-10］。流行病學資料表明，高度近視在亞洲國家更為普遍，其發病率高達10%～24%，遠高于西方國家的2.8%～4.6%［11］。我國近視人數多達6億，其中高度近視患者占總近視人數的近30%［12］。

高度近視的高發病率、高致盲率及其嚴重危害性一直是國際社會研究的熱點。目前對于近視的病因學研究尚無肯定的結論，主要以環境因素和遺傳因素為主［8，13］。家系研究表明，父母近視的發生率與子代近視的發生率呈正相關，而雙生子研究證明，近視的遺傳度在0.50～0.96之間，且同卵雙生子的屈光不正和屈光因素一致性比異卵雙生子高［14-16］。這些數據提示，高度近視具有明顯的遺傳基礎。高度近視具有多種遺傳方式，包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳以及伴X連鎖遺傳，且具有高度的遺傳異質性。傳統的研究方法是通過連鎖分析定位遺傳性疾病家系的致病基因位點區間，基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），尋找與家系疾病共分離的基因突變。這種方法存在耗時長、人力物力損耗大、無法大規模高效富集基因組片段等諸多弊端。隨著新一代測序技術的進步，外顯子組測序和靶向外顯子捕獲測序得到了快速發展，為尋找高度近視致病基因及其突變位點提供了契機。

外顯子組測序是利用序列捕獲技術，將全基因組外顯子區域DNA捕捉并富集后進行高通量DNA測序的基因組分析方法。它只需針對外顯子區域的DNA序列即可，且對常見和罕見變異具有高靈敏度，可發現絕大部分疾病外顯子區域的相關變異，僅需要對約1%的基因組進行測序，覆蓋度更深、數據準確性更高，更加簡便、經濟、高效，被認為是鑒定孟德爾疾病致病基因最為有效的策略之一，也被運用于尋找單基因病及多基因復雜疾病的致病基因和易感基因等的研究和臨床診斷中。目前，已通過外顯子組測序確定的高度近視致病基因主要有ZNF644、SCO2、LEPREL1、LRPAP1、CTSH、SLC39A5、P4HA2和GLRA2［17-27］。

人類NYX基因位于Xp11.4染色體上，有2個外顯子，編碼長度為481個氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇錨錠蛋白（nyctalopin），屬于亮氨酸富集蛋白（small leucine-rich proteoglycan，LSRP）家族成員［28-30］。nyctalopin主要在視網膜突觸層表達，對轉化受體電位陽離子通道亞家族M成員1（transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 1，TRPM1）的正常表達很重要［31］。有研究報道，NYX基因突變可能導致先天性靜止性夜盲癥（congenital stationary night blindness of the complete，CSNB1）；也有研究發現，NYX基因的突變與高度近視相關［22，28，32-36］。本研究中，我們收集到一個遺傳三代的高度近視家系，通過外顯子測序鑒定出NYX基因一個新的錯義突變c.790A＞T（p.N264Y）在該家系中與高度近視表型共分離。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究的家系來自中國廣西一個具有X連鎖遺傳的三代高度近視家庭。先證者在南寧愛爾眼科醫院進行了視力、屈光、裂隙燈、眼底檢查和視網膜電圖（electroretinogram，ERG）等一系列的眼科檢查。其他家庭成員的視力、屈光、裂隙燈檢查和抽血均由專業的醫生和護士上門完成。所有成員均沒有其他已知的眼部疾病或系統性疾病，并排除了早產兒視網膜病變、馬凡綜合癥和Stickler綜合癥等能導致近視表型的遺傳性疾病。

1.2 外顯子測序分析

采用苯酚-氯仿法從全血樣本中提取DNA［25］。選取先證者的DNA進行全外顯子組測序，對測序的結果進行嚴格的生物信息學分析。將外顯子組測序產生的原始數據比對到參考基因組hg19上［37］，然后用SAMTOOLS（http://SAMTOOLS.sourceforge.net/）進行單核甘酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）和插入缺失標記（insertion-deletion，INDEL）檢測［38］。過濾過程如下 ：1）刪除數據庫中高頻率變異；2）刪除純和變異；3）刪除對照中的變異；4）保留兩個患者共有而正常對照沒有的變異。

1.3 突變的篩查與驗證

對外顯子組測序得到的候選基因突變位點序列設計引物，利用Sanger測序驗證所有家族成員中該突變位點與表型的共分離狀態，并在正常對照、1000Genomes、 ESP6500和ExAc等數據庫中進行突變篩查，排除攜帶該位點的突變。使用primer3（http://primer3.ut.ee/）設計PCR引物［39］。測序結果與參考基因組hg19進行比對（http://genome.cse.ucsc.edu）［40-41］。錯義突變的功能預測及潛在的疾病風險預測工具為Polyphen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）［42］、SIFT（scale-invariant feature transform，http://sift.jcvi.org/www/SIFT_seq_submit2.html）［43］和Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org/）［44］。

2 結果與分析

2.1 家系臨床特征分析

本研究共采集該高度近視家系17個成員的DNA樣本（圖1）。家系中沒有女性患者，所有的男性患者在10歲以前都有近視史，近視度數從-5.25～-8.00 m-1不等。家系圖提示可能為X連鎖遺傳。先證者（M33022）表現出視乳頭周圍萎縮斑、視網膜變薄呈現豹紋狀眼底、可透見脈絡膜粗大血管、中心凹光反射消失等典型的高度近視眼底特征（圖2）。同時，先證者患有嚴重的弱視和眼球震顫，我們兩次檢測都無法獲得穩定的視網膜電圖。先證者及家人沒有夜盲癥的臨床表現。除了M33029個體患有內斜視外，其他受試者的視光檢查均正常（表1）。

圖1 X-連鎖遺傳高度近視家系的系譜結構圖Fig. 1 The pedigree structure of the family with X-linked high myopia

圖2 先證者（M33022）眼底照片Fig. 2 Fundus photographs of the proband (M33022)

表1 高度近視家系成員的臨床特征Tab. 1 Clinical features of the family members with high myopia

2.2 突變篩查結果

通過對先證者（M33022）進行外顯子測序發現，位于Xp11.4上NYX基因2號外顯子790位點的A突變為T，該變異導致nyctalopin第264位的Asn突變為Tyr。對家系成員進行PCR測序，發現NYX基因c.790A＞T突變與家系中高度近視患者共分離（圖3）。同時，測序未發現其他已知高度近視致病基因在家系中共分離。對100例對照進行PCR，然后測序，查詢1000Genomes、ESP6500和ExAc數據庫，排除該突變為已知SNP。通過對人類、東非狒狒、普通狨猴等17個物種NYX基因編碼的氨基酸序列進行比對，發現第264位的Asn在不同物種中都是保守的（圖4）。SIFT軟件預測p.N264Y是有害的，而polyphen-2軟件也預測其可能有害。因此，我們認為NYX基因c.790A＞T（p.N264Y）的突變可能是導致這個家族高度近視的原因。

圖3 正常人、攜帶者和高度近視患者在NYX基因c.790A＞T位點的測序結果Fig. 3 Sequence of the region encompassing the NYX c.790A＞T mutation in unaffected individual, obligatory carrier, and affected individual

圖4 不同物種NYX基因編碼氨基酸序列比對Fig. 4 Multiple sequence alignment for the NYX amino acid sequence

3 討論

在該高度近視家系中，我們檢測出NYX基因的一個新突變c.790A＞T（p.N264Y），該突變在家系中與高度近視患者共分離。其中，M33016右眼近視度數為 -2.75 m-1，左眼近視度數為 -3.25 m-1，未達到高度近視的診斷標準，由于樣本采集時僅為6歲，推測其高度近視表型可能還未充分顯現。另外，M33030個體測序顯示其在該位點序列為野生型，樣本采集時年齡為13歲，但是他的右眼為 -4.00 m-1，左眼為 -3.75 m-1，屬于中度近視。據監護人反映，該個體長期沉迷網絡游戲，這可能是其近視的主要原因。

NYX基因編碼的細胞表面蛋白具有11個連續的典型富含亮氨酸重復片段（leucine rich repeats，LRRs）［45-46］。p.N264Y突變位于第8個富含亮氨酸重復片段的第22個氨基酸，該氨基酸在17個物種中都是保守的。SIFT和polyphen-2軟件預測p.N264Y是有害變異。有研究報導，NYX基因c. 792C＞G突變引起的第264位Asn變為Lys與靜止性夜盲癥的發生有關［30］。多個報道表明，同一氨基酸突變為不同氨基酸后可引起不同臨床表型。例如：RHO基因p.G90D突變引起類似夜盲癥的癥狀，而p.G90V則表現為典型的視網膜色素變性［47-48］；FGFR3基因p.K650M的突變引起I型致死性異型增生，p.K650E突變引起Ⅱ型致死性異型增生，p.K650Q/N的突變則引起輕度的增生［49-51］。我們的研究表明，靜止性夜盲癥與高度近視之間存在復雜的關系，這有助于我們了解NYX基因型與表型的關系。

到目前為止，有3個研究涉及到6個NYX基因位點的突變與高度近視有關，分別是c.144C＞G［20］、c.572_573GC＞AA［20］、c.529_530GC＞AT［26，34］、c.626G＞C［34］、c.121delG［34］和 c.335T＞C［34］。c.144C＞G突變是在一個雙眼均近視-12.00 m-1的8歲男孩患者基因中發現的，c.572_573GC＞AA突變是在一個雙眼近視均為-6.50 m-1的46歲男性患者基因中發現的，c.529_530GC＞AT突變分別在一位46歲男性患者（右眼-10.50 m-1，左眼-9.00 m-1）和一位15歲男性患（右眼-21.00 m-1，左眼-20.00 m-1）中發現，c.626G＞C突變是在一個5歲小男孩患者（右眼-9.00 m-1，左眼-10.00 m-1）中發現的，c.121delG突變是在一位31歲男性高度近視患者（右眼-16.00 m-1，左眼-9.50 m-1）中發現的，c.335T＞C突變是在一位11歲的小男孩患者（右眼-10.00 m-1，左眼-11.00 m-1）中發現的。以上6個與高度近視相關的突變位點均在中國人群中發現，c.790A＞T也是在中國人群中發現的。這些研究結果表明，種族群體之間特定的遺傳變異在很大程度上導致了個體表型的差異［52］。

NYX基因c.790A＞T突變既沒有在100名無親緣關系的正常對照中檢測到，也沒有在相關的數據庫中發現，說明該突變是罕見位點突變，是高度近視的危險因素。雖然生物信息學軟件也預測該位點的突變是有害的，但我們的研究尚缺乏試驗證據證明該變異能夠引起蛋白質功能的改變，需要進一步的研究來闡明p.N264Y突變引起高度近視的作用機制，這也是我們下一步將繼續開展的工作。

本文在一個三代高度近視家系中發現了錯義突變的NYX基因c.790A＞T（p.N264Y），并且NYX蛋白質第264位氨基酸的變化可導致不同的表型。該發現擴大了NYX基因的突變譜，為進一步闡明其基因型-表型關系提供了有用的信息。