黃瓜硫酸鹽轉運蛋白家族成員的鑒定與表達分析

趙 聞，廖偉民，趙金棟，刁慧貞，江孟濤，蔣倫偉

（江西農業大學生物科學與工程學院，南昌 330045）

硫（sulfur）作為植物體中所需的6種大量元素之一，是硫胺素、甲硫氨酸、半胱氨酸、鐵氧化還原蛋白、生物素等有機物的重要組成部分，廣泛參與植物的生長發育過程。硫酸鹽（SO42-）是土壤中硫營養的主要存在形式，根系從土壤環境中吸收SO42-的能力是影響植物硫素營養狀況的重要因素之一。植物體內的硫以無機硫酸鹽和有機硫化合物的形式存在。其中SO42-主要貯藏在液泡中，有機態硫則主要以含硫氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸及谷胱甘肽等化合物存在于植物體內的各器官中。

大量研究發現，無論是植物從土壤中吸收硫，還是SO42-在細胞內的運輸都離不開硫酸鹽轉運（sulfate transporter，SULTR）蛋白。SULTR蛋白的C端具有抗σ因子拮抗（sulfate transport anti-sigma，STAS）結構域，N端具有硫轉運結構域，同時還包含12個跨膜結構域（transmembrane domains，TMDs）［1］。SULTR基因通常是以家族的形式存在于不同植物中的，迄今為止已經在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［2］、高粱（Sorghum bicolor）［3］、小麥（Triticum aestivum）［4］、蘋果（Malus domestica）［5］、山黧豆（Lathyrus sativus）［6］、茶樹（Camellia sinensis）［7］等植物中得到鑒定。擬南芥SULTR基因家族共有12個成員，根據其亞細胞定位、序列同源性及功能特性可分為4個亞家族（SULTR1～4），分別負責不同組織和胞內SO42-的轉運。它們在不同的組織中以不同水平表達，其親和力和表達方式的差異體現了它們各自在功能上的差異。其中，高親和力的SULTR一般在根部特異性表達，主要負責吸收土壤中的硫；低親和力的SULTR主要在葉片中表達，負責調節植物細胞間硫的轉運。如在低硫脅迫時，AtSULTR1;1和AtSULTR1;2能促使硫酸鹽進入根；其中AtSULTR1;2是主要的硫酸鹽吸收者，At-SULTR1;2基因的缺失會導致大幅降低植物硫酸鹽的吸收，而AtSULTR1;1僅在低硫條件下表達，從而輔助AtSULTR1;2增強植物對硫酸鹽的吸收［8］。At-SULTR1;3則位于韌皮部，參與硫酸鹽從地上部分向根部的轉運；而AtSULTR3;5可以促進硫酸鹽由根系到地上部分的運輸［9］；AtSULTR4;1和AtSULTR4;2定位于液泡膜，在低硫環境脅迫下可以通過把液泡中的SO42-釋放到維管組織中來調節根系組織液泡的硫貯存能力［10］。除SO42-的轉運外，一些SULTR蛋白還參與硒酸鹽的轉運，其表達受硒酸鹽和硫酸鹽的調控［11-12］。如茶樹CsSULTR3.5基因在短時間內能夠快速響應硫酸鹽的誘導，而硒酸鹽需要較長時間才能誘導其表達［11］。此外，SULTR蛋白還廣泛參與植物的脅迫應答過程，如重金屬［3］、低溫［13］、干旱、鹽等非生物脅迫［14-16］。如在鎘脅迫下，高粱SbSULTR1;2、SbSULTR1;3、SbSULTR3;3、Sb-SULTR3;5，以及擬南芥AtSULTR1;1、AtSULTR1;2、AtSULTR1;3、AtSULTR2;1、AtSULTR2;2等基因的表達量明顯上調［3］。AtSULTR3;1的缺失影響了脫落酸（abscisic acid，ABA）的合成，從而改變了植株在種子萌發和根系生長階段對于外源ABA的響應［16］。

黃瓜是一年蔓生植物，因富含維生素、糖類、胡蘿卜素、鐵等營養成分以及其種植簡單的特性在世界各地被廣泛種植，是一種重要的經濟農作物。霜霉病是黃瓜生產中的重要病害之一，它是由古巴假霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis）侵染所引起的一種葉部病害，嚴重時會導致黃瓜大面積枯死，造成嚴重的經濟損失。SULTR基因作為硫酸鹽吸收和轉運過程中的關鍵基因，在含硫營養代謝以及脅迫應答中發揮著重要的作用。但是迄今為止，黃瓜SULTR基因家族成員尚未被鑒定。本研究利用生物信息學的方法和相關軟件鑒定黃瓜SULTR基因家族成員，并對該基因家族的組成、結構、進化關系、保守性、編碼蛋白及表達模式進行分析，為將來探究該家族基因潛在的生物學功能提供參考，為探究黃瓜硫的同化及霜霉病的抗性機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 黃瓜SULTR基因家族的全基因組鑒定

從NCBI下載12條擬南芥SULTR蛋白作為參考序列，在黃瓜基因組網站（http://cucurbitgenomics.org/organism/2）進行BLAST，e值設置為0.01；同時，在PFAM數據庫（http://pfam.xfam.org/）中下載基因的HMM（Hidden Markov Model）種子文件（PF00916和PF01740），運用HMMER v3.0軟件對黃瓜v2蛋白數據庫進行掃描。整理BLAST與HMMER結果，除去冗余基因，并通過PFAM和SMRAT網站（http://smart.embl-heidelberg.de/）鑒定候選序列是否同時具有SULTR蛋白的兩個特征結構域，最后符合條件的被列為黃瓜SULTR基因家族成員。

1.2 黃瓜SULTR基因染色體定位與蛋白理化性質分析

在黃瓜基因組網站中提取黃瓜SULTR基因的染色體位置信息和蛋白序列，通過ExPASy數據庫（http://web.expasy.org/）預測黃瓜SULTR蛋白的親疏水性均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）、等電點（isoelectric point，pI）、相對分子質量（molecular weight，MW）和氨基酸數目。通過Plant-mPLoc數據庫（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測黃瓜SULTR蛋白的亞細胞定位。

1.3 黃瓜SULTR家族成員蛋白系統進化樹分析

參考之前的文獻［17］，使用MAFFT在線服務器（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）對擬南芥和黃瓜2個物種SULTR基因家族的蛋白序列進行比對，構建系統發育樹，并利用MEGA7.0軟件對系統發育樹進行可視化分析。

1.4 黃瓜SULTR基因結構及啟動子順式作用元件分析

利用 Gene Structure Display Server服務器（GSDS，http://gsds.gao-lab.org/）對黃瓜SULTR基因的編碼序列（coding sequence，CDS）和基因組序列（genomic DNA，gDNA）進行比對，分析CsaSULTR基因中CDS、非編碼區（untranslated region，UTR）與內含子的結構分布。在PlantCARE數據庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上提交黃瓜SULTR基因起始密碼子（ATG）上游2 000 bp啟動子序列，分析啟動子區域中與生長發育、逆境脅迫以及激素應答相關的順式作用元件。

1.5 黃瓜SULTR基因表達分析

在NCBI網站中下載黃瓜不同組織（包括根、莖、葉、雄花、雌花、卷須、子房等，編號PRJNA80169）和霜霉病處理不同時期（編號PRJNA285071）的RNA-seq數據［18-19］，根據前人的文獻進行數據化處理，并以TPM（transcripts per million）值進行可視化［17，20］。

2 結果與分析

2.1 CsaSULTR基因的全基因組鑒定及染色體定位

基于黃瓜v2蛋白數據，利用HMMER軟件比對搜索種子文件（PF00916和PF01740），同時利用已發表的擬南芥SULTR序列，對黃瓜v2蛋白數據進行檢索，進一步通過保守結構域分析，最終鑒定獲得10個黃瓜SULTR基因家族成員。根據這10個基因及與擬南芥SULTR基因的親緣關系將它們命名為CsaSULTR1;1～CsaSULTR4;1（表1）。這些基因不均等分布在黃瓜的3號、4號、5號、7號染色體上，其中5號染色體上含有的CsaSULTR基因最多（共4個），3號染色體上分布的CsaSULTR基因最少（共1個）。對CsaSULTR基因序列分析發現，Csa-SULTR3;3的gDNA最長（10 307 bp），CsaSULTR1;2的gDNA長度最短（4 189 bp）（表1）。

2.2 黃瓜SULTR蛋白理化性質分析

通過分析蛋白的理化性質發現，黃瓜SULTR蛋白相對分子質量在70.93（CsaSULTR2;1和CsaSULTR3;2）～76.69 kD（CsaSULTR4;1）之間，pI在8.48（CsaSULTR3;2）～9.30（CsaSULTR2;1）之間。亞細胞定位預測表明，除CsaSULTR4;1定位于葉綠體外，其他CsaSULTR蛋白全部定位于細胞膜上（表1）。

表1 黃瓜SULTR家族成員基本信息Tab. 1 Basic information of the SULTR gene family in cucumber

2.3 黃瓜SULTR基因家族成員系統發育分析與分類

進化樹分析表明，擬南芥和黃瓜SULTR蛋白可分為4組（GROUP 1～4）：第1組中包含3個Csa-SULTR成員（CsaSULTR1;1、CsaSULTR1;2、CsaSUL-TR1;3）；第2組包含2個CsaSULTR成員（CsaSULTR2;1、CsaSULTR2;2）；第3組包含4個CsaSULTR成員（CsaSULTR3;1、CsaSULTR3;2、CsaSULTR3;3、Csa-SULTR3;4）；第4組包含1個CsaSULTR成員（Csa-SULTR4;1）（圖1）。此聚類結果與擬南芥、水稻、高粱、玉米等物種一致［3，14］。

圖1 擬南芥與黃瓜SULTR家族成員的系統進化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of SULTR family members from Arabidopsis and cucumber

2.4 黃瓜SULTR家族成員基因結構分析

基因結構分析結果表明，CsaSULTR基因均含有較多數量的內含子（圖2）。其中CsaSULTR1;1含有9個內含子，其余的CsaSULTR基因包含10～16個數量不等的內含子。此外，屬于同一組的CsaSULTR基因含有相似的基因結構，與系統發育分析的結果一致。如CsaSULTR3;1和CsaSULTR3;2內含子的數量分別都為11個，而且每個外顯子的長度都非常相似。

圖2 黃瓜SULTR家族成員基因的結構分析Fig. 2 Gene structure analysis of SULTR family members in cucumber

2.5 黃瓜SULTR基因啟動子順式作用元件分析

為了對SULTR基因的轉錄調控進行深入的了解，本文利用PlantCARE數據庫對10個CsaSULTRs上游2 000 bp位點內的激素反應與脅迫應答元件進行了分析，結果如圖3所示。在激素反應元件中，ABA 響應元件（abscisic acid responsive element，ABRE）含量最多，每一個CsaSULTR基因的啟動子中均含有不同數量的ABRE元件。在脅迫應答元件中，抗厭氧元件（anaerobic induction element，ARE）的基因數目含量最多，分布在除CsaSULTR2;2和Csa-SULTR3;2外的其他CsaSULTR基因中。這些結果表明，CsaSULTR基因可能在黃瓜的生長發育、激素應答及脅迫應答過程中具有重要功能。

圖3 黃瓜SULTR基因順式作用元件分析Fig. 3 Cis-acting elements in the promoters of each SULTR gene in cucumber

2.6 黃瓜SULTR基因在不同組織下的表達模式分析

利用TBtools軟件，基于現有的RNA-seq數據繪制黃瓜CsaSULTR基因在根、莖、葉、雄花、雌花、卷須、子房等7個不同組織的表達模式熱圖，結果如圖4所示。CsaSULTR1;1和CsaSULTR1;3在各組織中的表達量都非常低，甚至不表達，其余基因至少在一個組織中存在高表達。其中CsaSULTR2;2在雌花中高表達，而在莖中卻檢測不到表達；CsaSULTR3;1基因在根、雄花、雌花和子房中表達最高；CsaSULTR1;2和CsaSULTR2;1基因在雄花中表達最高；CsaSULTR3;4在根和雄花中表達最高。不同的CsaSULTR基因的表達量與表達模式不盡相同，表明黃瓜SULTR基因的功能存在著組織特異性。

圖4 黃瓜CsaSULTR基因的組織表達譜Fig. 4 Tissue expression profiles of cucumber CsaSULTR genes

2.7 黃瓜SULTR基因在霜霉病菌侵染下的表達分析

為了確定黃瓜SULTR基因的表達是否受到霜霉病菌侵染的響應，本文利用前人發表的RNA-seq數據［18］，在霜霉病菌侵染不同時間點的PI 197088（霜霉病高抗品種）和Vlaspik（霜霉病高感品種）中對CsaSULTR基因的表達量進行了分析（圖5）。結果表明，在霜霉病菌侵染后的Vlaspik中，Csa-SULTR1;2、CsaSULTR2;1、CsaSULTR2;2、CsaSULTR3;1、CsaSULTR3;3的表達量明顯呈下降趨勢，而CsaSULTR3;4和CsaSULTR4;1表達量明顯上升。在PI 197088中，CsaSULTR3;2、CsaSULTR4;1、Csa-SULTR1;2、CsaSULTR2;2接種霜霉病菌后的表達量均呈上升趨勢，而CsaSULTR3;1、CsaSULTR3;3、CsaSULTR2;2接種霜霉病菌1 d后的表達量明顯下降，隨后上調表達或恢復至對照水平。

圖5 黃瓜CsaSULTR基因在霜霉病菌侵染脅迫下的表達模式Fig. 5 Expression pattern of cucumber CsaSULTR genes during Pseudoperonospora cubensis infection

3 討論

SULTR蛋白在植物吸收土壤中硫的過程中發揮著重要的作用。近年來，許多SULTR基因已經在各種植物物種中被相繼報道。如擬南芥和水稻中被報道各有12個SULTR基因［5］，高粱中有11個［3］，小麥中有10個［4］，蘋果中有9個［5］，茶樹中有8個［7］。本研究利用生物信息學方法在黃瓜中共鑒定得到了10個CsaSULTR基因，它們不均等地分布在4條染色體上。理化性質結果表明，所有CsaSULTR蛋白的pI值都大于7，表明它們均呈堿性，與茶樹、土豆、高粱等物種的研究相一致，表明CsaSULTR蛋白與其他物種一樣，需要在堿性條件下才能發揮其對硫的吸收轉運等功能。此外，絕大部分CsaSULTR蛋白均定位于質膜上，故可推測這些CsaSULTR蛋白可能在質膜中發揮其轉運功能，這與先前報道的茶樹［3］、高粱［7］等物種SULTR蛋白主要定位于質膜上相同，表明SULTR蛋白在不同物種間具有相似或相同的功能。此外，亞細胞定位預測結果表明，CsaSULTR4;1定位于葉綠體上，暗示其可能負責轉運硫酸鹽到葉綠體，參與葉綠體硫酸鹽的代謝。

通過對擬南芥和黃瓜的系統發育樹分析，上述CsaSULTR成員可分為GROUP 1～4四組，且親緣關系較近的CsaSULTR成員的基因結構非常相似。這些結果與先前報道的擬南芥、茶樹、玉米等的SULTR基因家族一致［7，15］。此外，CsaSULTR基因的啟動子分析顯示，這10個CsaSULTR基因的上游區存在較多的激素響應和脅迫應答等多種順式作用元件。需要特別指出的是，植物激素同樣能調節硫營養的運輸和同化代謝過程。如硫酸鹽及其同化產物Cys可以影響ABA合成途徑中關鍵酶ABSCISIC ALDEHYDE OXIDASE 3（AAO3，EC 1.2.3.1）的活性，從而調節ABA的生物合成［16，21］。所有CsaSULTR基因對ABA的響應元件數量居多，表明CsaSULTR基因在黃瓜ABA合成過程中可能有著較為重要的作用。在脅迫應答方面，除Csa-SULTR3;2外，其余CsaSULTR基因中均包含數量不等的脅迫應答響應元件，表明它們可能在脅迫應答過程中發揮一定的作用。之前在玉米中的研究表明，除ZmSULTR3;3外，其余ZmSULTR基因均能夠響應干旱、高鹽和高溫等非生物脅迫［15］。當土壤中含硫量較低時，在大豆中過表達GmSULTR1;2b基因能增強大豆對缺硫脅迫的耐受性，從而提高作物的產量［22］。

對黃瓜SULTR基因的組織表達模式分析表明，SULTR基因在黃瓜中具有組織特異性。例如：Csa-SULTR2;2不在莖中表達，可能不參與莖中硫元素的運輸傳遞；CsaSULTR3;1、CsaSULTR3;4在根、雄花、雌花和子房中表達量最高，表明兩者在黃瓜的花房發育過程中發揮著重要的作用。這與之前報道的一些物種的SULTR基因表達模式相同。例如：擬南芥AtSULTR1亞家族主要在根系中表達，負責在根部于外界環境中攝取轉運硫酸鹽［8］；AtSULTR2亞家族主要在維管組織中表達，負責組織間硫的分布［23］。茶樹中除CsSULTR1;1和CsSULTR3;2外，其余6個CsSULTR基因在處于休眠期的莖中高量表達［7］。大豆的SULTR1;2b基因與油菜的SULTR2;2基因在根中特異性表達［24］。最近的研究表明，谷子SiSULTR2.1也具有組織表達特異性，且在谷子莖、葉片中表達量較高［25］。此外，在親緣關系相近的一些CsaSULTR之間，基因表達量也較為相似。例如：CsaSULTR1;1與CsaSULTR1;3在各組織中都低量表達或不表達；CsaSULTR2;1與CsaSULTR1;2都在雄花中表達量最高，在卷須中表達量最低；CsaSULTR3;1與CsaSULTR3;4都在根中表達量最高，在卷須中表達量最低（圖4）。而第3亞家族和第4亞家族的CsaSULTR成員基因表達量相對于第1亞家族和第2亞家族要高出許多，具有明顯的差異，且親緣關系相近的基因結構也較為相似（圖2）。這些結果表明，親緣關系相近的CsaSULTR基因可能在黃瓜的同一組織中具有相似的硫轉運功能，同時，它們可能在黃瓜對SO42-吸收轉運的不同環節與過程中發揮作用。

硫營養與激素之間的信息交流是與環境脅迫的響應等交織在一起的，是植物對營養和其他環境脅迫適應所作出的自我調節的反應。大部分CsaSULTR基因啟動子的上游區存在較多的ARE以及水楊酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）相關的順式作用元件，暗示CsaSULTR基因可能參與生物脅迫響應。本研究在霜霉病高抗品種PI 197088和霜霉病高感品種Vlaspik中對CsaSULTR基因響應霜霉病菌誘導的表達變化進行了對比分析，結果表明，僅有CsaSULTR4;1在兩個品種中均表現出上調表達，特別是在病原菌處理早期（2 dpi）。而Csa-SULTR3;1、CsaSULTR3;3、CsaSULTR2;2在兩個品種中均表現出下調表達，但它們的表達量在高感品種接種霜霉病菌1～7 d后均呈下調趨勢，而在高抗品種中僅在病原菌處理早期（1 dpi）明顯下降，隨后上調表達或恢復至對照水平。此外，CsaSULTR2;1、CsaSULTR1;2僅在高感品種中表現出明顯的下調表達，而CsaSULTR3;2和CsaSULTR3;4分別僅在高抗品種和高感品種中表現出明顯的上調表達。這些結果表明，CsaSULTR基因可能在黃瓜抵御霜霉病菌侵染過程中發揮了重要的作用。