水稻甜質胚乳突變體m5788的鑒定及基因定位

鄭思怡 楊 曄 宋遠輝 花 芹 林泉祥 張海濤 程治軍

（1安徽農業大學農學院，230036，安徽合肥；2中國農業科學院作物科學研究所，100081，北京）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上主要的糧食作物之一。淀粉是稻米的主要成分（占90%以上），胚乳中淀粉的組成、性狀和排列方式對稻米的外觀和食味品質起著至關重要的作用[1]。隨著人們生活質量的提高，對稻米品質的要求也隨之提高，稻米品質改良逐漸成為水稻育種家們重點關注的問題。淀粉主要有直鏈淀粉和支鏈淀粉2種形式。前者是由D-葡萄糖基以α-1,4-糖苷鍵連接的線性葡聚糖鏈，后者除此之外，還有α-1,6-糖苷鍵連接的分支鏈[2]。

研究[3]表明，直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成涉及ADP-葡萄糖焦磷酸酯酶（ADP-glucose pyrophosphorylases，AGPase）、淀粉合成酶（granule bound starch synthase，GBSS）、可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SS）、淀粉分支酶（starch branching enzyme，BE）、淀粉去分支酶（starch debranching enzyme，DBE）和質體淀粉磷酸化酶（plastidial starch phosphorylase，Pho)等路徑。高等植物中的DBE存在著支鏈淀粉酶（pullulanasetype，PUL）和異淀粉酶（isoamylase-type，ISA）2種不同的底物特異性酶。PUL主要參與普魯蘭多糖和支鏈淀粉的支鏈修飾，ISA通過去除BE形成的支鏈淀粉過度分支，從而將植物支鏈淀粉和糖原轉變為組織更強、支鏈較少的支鏈淀粉[4]。

在玉米中，Sugary 1基因編碼ISA1的等位基因，突變體sugary 1胚乳淀粉含量減少，可溶性糖積累，籽粒皺縮[5]。2019年，Takahashi等[6]分離出了一種新型甜米突變體hemisugary1，其籽粒中含有未去分支的短鏈高分子，植物糖原由于ISA活性降低而積累，從而改善了甜質胚乳突變體典型的皺縮表型，外觀表現為籽粒中等皺縮。在其他作物如硬粒小麥中，敲除ISA1會導致胚乳中的淀粉含量降低，植物糖原和植物葡聚糖含量增加，改變了支鏈淀粉的精細結構[7]。在馬鈴薯中同時降低3個ISA基因（ISA1、ISA2和ISA3）的表達量會導致淀粉代謝缺陷，使得塊莖中淀粉含量降低和淀粉顆粒尺寸減小[8]。在水稻中，Peng等[9]發現突變體isa1的含糖胚乳缺少淀粉顆粒，基因ISA1與FLO6（一種結合淀粉的碳水化合物結合結構域蛋白編碼基因）相互作用，作為淀粉結合蛋白參與淀粉合成和復合顆粒的形成。李家洋等[10]在第8號染色體上發現了一個控制水稻甜質胚乳的基因SU1，該突變體可溶性多糖含量高，胚乳帶有甜味，可能編碼一種參與支鏈淀粉生物合成的ISA。2015年，趙華等[11]通過組織培養得到了水稻糖質胚乳突變體sug-11，胚乳呈甜味，籽粒皺縮，其成熟籽粒中的蔗糖和可溶性糖含量約為野生型中花11的3倍。2018年，Du等[12]在水稻中鑒定了一個編碼淀粉去分支酶ISA1突變的穗發芽突變體phs8，由于胚乳含糖量增加，導致OsABI3和OsABI5的表達量降低，對脫落酸敏感性降低，表明甜質胚乳突變還會影響種子的休眠和萌發。

甜質胚乳突變體是一種特異的淀粉合成突變體，被認為是新型功能性食品開發的重要原料，也是健康食品的新材料。挖掘和利用甜質胚乳突變體，對于開發具有保健功能的稻米產品具有積極意義。本研究以水稻甜質胚乳突變體m5788為研究材料，在精細定位的基礎上，比較了突變體與之前報道的甜米材料的關系，發現它是一個水稻ISA1位點新的等位變異，是研究該基因表達調控難得的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜質胚乳突變體m5788是從粳稻品種中花11組織培養后代中篩選得到的。在安徽合肥和北京自然環境條件下，經多年種植，其綜合農藝性狀與對照品種中花11十分相近，胚乳突變性狀均能穩定遺傳，成熟胚乳呈甜味。2019年將其與正常胚乳品種IRAT129配制雜交組合，2019年冬，在海南南繁后收獲的F1種子脫殼磨米，挑選甜質米，經滅菌消毒后，無菌條件下培養成苗并進行基因定位。田間管理同大田生產。種子自然風干后測定千粒重。

1.2 試驗方法

1.2.1 表型分析 大田材料成熟后，隨機選取突變體m5788與野生型各10株，考察株高、主莖穗長、節間長、主穗粒數、一次枝梗數、二次枝梗數和結實率等農藝性狀。

1.2.2 理化性質測定 中花11和m5788成熟種子風干去殼后，利用Perten公司的DA7200型近紅外光譜儀測定直鏈淀粉含量、膠稠度、蛋白質和水分含量等品質指標，每個材料測定3次。

采用蒽酮比色法[13]測定可溶性糖含量，待水稻在田間生長發育至開花期，于上午11:00-11:30取生長發育一致的植株的旗葉和穗，液氮冷凍，放入-80℃冰箱保存待測。待水稻在田間生長發育至成熟期，取成熟籽粒，液氮冷凍，放入-80℃冰箱待測，每個材料測定3次。

1.2.3 I2-KI染色 取10粒種子，去粰殼，在30℃條件下清水浸種24h，設置3次重復。用濾紙吸干種子表面水分，加20μL 2% I2-KI溶液，完全浸染后用吸水紙吸干多余溶液，在BA410型顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.4 目標基因定位及分子標記的開發 以中花11和IRAT129為親本，篩選出均勻分布于12條染色體具有多態性的197對SSR和Indel標記，利用20株F2隱性極端個體，通過TPS法提取葉片總DNA，構建DNA混池，篩選連瑣標記。再根據連鎖結果，開發新的標記，擴大定位群體，對目標基因進行精細定位（表1）。利用Gramene（http://www.gramene.org）和 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫進行新標記開發，對比日本晴和9311基因組序列，尋找插入/缺失位點，用Primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0）軟件開發SSR標記，在RAP-DB/HOME的Blast網站（https://rapdb.dna.affrc.go.jp）比對特異性，將特異性較好的引物送至北京擎科生物有限公司合成。PCR擴增采用10μL反應體系：PremixTaq5μL、正反向引物（10μmol/L）共1μL、DNA模板1μL和 ddH2O 3μL。PCR 反應條件為94°C預變性2min；94°C 變性30s，55℃～58℃退火30s，72°C延伸1min，設置35個循環；72°C延伸5min，4°C保存。PCR產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色后觀察拍照并記錄。

表1 新開發的Indel和SNP分子標記Table 1 New developed polymorphic Indel and SNP primers used for fine mapping

1.2.5 RNA提取與qRT-PCR表達量分析 取10cm幼穗，用RNA試劑盒（北京康潤生物科技有限公司）提取總RNA，用RNA反轉錄試劑盒（江蘇愚公生命科技有限公司）獲得cDNA。利用ISA1和PUL基因的蛋白質編碼區序列設計擴增引物（表2），內參采用水稻Ubiqutin（Os03g0234200），采用Takara公司試劑盒TB Green?Premix ExTaq?II（Tli RNaseH Plus）反應體系，在BIO-RAD CFX96TMReal-Time System（BIO-RAD，美國）上進行擴增反應。每個樣品重復3次，以2-ΔΔCT計算相對表達量。

表2 qRT-PCR所用引物Table 2 Primers used for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 野生型和突變體m5788的表型分析

突變體m5788來自于粳稻品種中花11的組織培養后代，經多年的田間觀察發現，籽粒皺縮性狀表現穩定。農藝性狀考察發現，m5788平均株高為100.2±2.7cm，低于野生型（117.0±2.8cm），突變體的各節間長度都相對較短，穗長縮短了14.9%（圖1a～b和表3）。m5788突變體的分蘗數（12.6±1.9）顯著多于野生型（9.5±2.1），有效穗數極顯著高于野生型。與野生型相比，m5788穗粒數（184.0±12.3）僅是野生型（278.0±45.8）的66.2%。突變體的千粒重（15.6±0.87g）僅為野生型（29.6±1.95g）的52.7%（表3）。野生型糙米飽滿、胚乳有堊白、部分透明，而m5788突變體糙米皺縮、胚乳透明（圖1c～d）。用I2-KI染色發現，野生型胚乳被染成紫黑色，m5788突變體胚乳被染成淡紫色，說明野生型籽粒淀粉合成和積累正常，而突變體的籽粒淀粉積累不正常（圖1e）。

圖1 野生型和突變體m5788的表型鑒定Fig.1 Agronomic traits comparison between wild type and the mutant m5788

表3 野生型和突變體m5788農藝性狀比較Table 3 Comparison of agronomic traits between wild type and the mutant m5788

2.2 野生型和突變體m5788籽粒品質的理化指標分析

對m5788和野生型籽粒中蛋白質、直鏈淀粉、脂肪酸含量和膠稠度等幾個關鍵品質性狀的測定結果（表4）表明，胚乳糖質突變對稻米品質的理化特性產生了較明顯的影響。m5788蛋白質含量為7.58%，較野生型的5.67%增加了1.91個百分點，直鏈淀粉含量增加了0.36個百分點，脂肪酸含量增加了1.52個百分點。由于直鏈淀粉含量沒有下降，因此，突變體淀粉總量的減少可能發生在支鏈淀粉上，與支鏈淀粉有關的膠稠度降低了14.66個百分點，也間接支持這一結論。

表4 野生型和突變體品質指標比較Table 4 Comparison of quality index between wild type and the mutant %

2.3 野生型和突變體m5788籽粒灌漿特性分析

由于m5788籽粒皺縮，淀粉積累少，可能是突變體由糖到淀粉的合成步驟出了問題。開花期旗葉、穗和成熟期籽?？扇苄蕴呛浚▓D2）表明，與野生型相比，m5788開花期旗葉葉片可溶性糖含量為0.33mmol/L，穗部可溶性糖含量為0.42mmol/L，野生型的相應含量分別為0.21和0.23mmol/L，差異均達到了極顯著水平；在籽粒的灌漿過程中，野生型和m5788可溶性糖含量的差距逐漸增大。突變體成熟籽粒可溶性糖含量為1.83mmol/L，野生型為1.00mmol/L，突變體約為野生型的1.8倍。

圖2 野生型和突變體不同時期可溶性糖含量比較Fig.2 Comparison of soluble sugar content between wild type and mutant at different stages

2.4 遺傳分析

以突變體m5788為母本與正常胚乳品種IRAT129雜交，構建遺傳作圖群體。F1植株所結種子的胚乳出現明顯的性狀分離，隨機抽取341粒F1成熟種子，將去殼糙米置于X線光片觀影燈下計數發現，其中正常胚乳籽粒和皺縮胚乳籽粒數目分別為277和64。符合3:1（χ2=1.09＜χ20.005=3.84）的理論分離比例。由此推斷，突變體m5788的皺縮胚乳性狀受1對隱性核基因控制。

2.5 精細定位

從F2群體中隨機選取20個突變體隱性單株構建2組DNA混池，利用篩選出的分布于水稻全基因組的197對多態性引物，進行突變基因的連鎖分析，初步確定第8號染色體上的Indel引物Z8-24和Z8-26.2與突變基因連鎖，再利用66個F2極端單株對2個標記進行驗證。利用Gramene網站（http://ensembl.gramene.org/genome）的秈粳稻基因組序列對比信息，在初定位區間新開發了4個SNP分子標記（Z8-25.6、Z8-25.7、Z8-25.8和Z8-25.9），利用569個F2隱性突變體單株，最終將突變基因定位在了標記Z8-25.8和Z8-25.9之間物理距離為110kb區間內（圖3b）。

圖3 候選基因M5788的圖位克隆Fig.3 Schematic diagram of map-based cloning on the candidate gene M5788

根據水稻基因組數據庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/），該區間內存在14個基因和3個轉座子（表5），其中包含1個前人[12]已經進行功能驗證的甜質胚乳基因OsISA1。

表5 定位區間內基因的功能注釋Table 5 Gene annotations in the mapping interval

利用phyto-zome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）上公布的LOC_Os08g40930基因翻譯序列，在NCBI數據庫中搜索顯示，水稻的ISA1與其他物種如擬南芥、大麥、小麥、玉米中的Sugary1蛋白高度同源（圖4）。且與已經報道[12]過的玉米甜質基因Sugary 1（GRMZM2G138060）的同源性高達82.2%。

圖4 LOC_Os08g40930與不同物種同源基因構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of LOC_Os08g40930 homologs

對LOC_Os08g40930的啟動子和編碼區進行測序，結果表明在野生型和突變體之間序列不存在差異，但qRT-PCR的結果表明，突變體中該基因的表達水平下調，預示著表達水平的下降可能是導致表型變異的主要原因。對同屬于淀粉去分支酶基因OsPUL進行了表達量分析，結果（圖5）表明在突變體m5788中OsPUL表達量也顯著下降。突變體胚乳DBE途徑中的2種底物特異性酶ISA1和PUL的基因表達量均大幅度降低，進一步說明了DBE途徑的代謝出現問題，其主要原因是ISA1基因發生了突變，而PUL基因表達量變化可能是負調控的結果。

圖5 OsISA1和OsPUL在野生型和突變體中表達量的比較Fig.5 Comparison of expression levels of OsISA1 and OsPUL in wild type and mutant

3 討論

胚乳直接決定稻米的品質和用途。甜質水稻胚乳因可溶性糖含量多，淀粉含量少，被認為是新型功能性食品原料。水稻甜質胚乳突變體m5788是粳稻品種中花11的組織培養后代，籽粒自然風干后胚乳皺縮，千粒重和穗粒數明顯下降，成熟籽粒中的可溶性總糖含量約是其野生對照品種中花11的1.8倍，胚乳呈甜味。突變基因被定位在8號染色體Z8-25.8和Z8-25.9之間物理距離為110kb的區間內。區間內LOC_Os08g40930基因的表達量在突變體內顯著下調，該基因表達量的下降可能是造成突變體表型變化的原因。

DBE具有ISA和PUL 2種類型的酶。ISA主要分解植物糖原和支鏈淀粉，而PUL作用于普魯蘭多糖和支鏈淀粉，但不作用于植物糖原。在植物中至少存在3種ISA（ISA1、ISA2和ISA3）基因，但到目前為止PUL只報道了1種[14]。在淀粉生物合成中，ISA可以通過編輯過多支鏈或去除支鏈酶來去除不適當分支的支鏈，以維持其簇狀結構，形成淀粉顆粒中的結晶。研究[15]表明，缺乏DBE蛋白的擬南芥突變體isa1/isa2/isa3/lda的葉片中沒有淀粉顆粒，但積累了高度分支的葡聚糖。在本研究中，中花11糙米籽粒飽滿，胚乳有堊白，表現為部分透明，而m5788糙米皺縮，胚乳透明，幾乎不存在結晶，推測m5788中ISA基因受損，無法去除淀粉生物合成過程中形成的不適當分支，導致支鏈淀粉的簇狀結構無法維持。試驗證實ISA1表達量降低與推測結論相符。但是另外2個ISA基因（ISA2和ISA3）對m5788突變表型的影響還需進一步研究。

與ISA相比，另一個淀粉去分支酶類型PUL的生理功能研究報道較少。PUL參與淀粉的生物合成，PUL的水解活性有助于淀粉的分解代謝，補償了ISA部分缺陷，在谷類胚乳淀粉的生物合成過程中具有重要作用[16]。在水稻中，編碼普魯蘭酶的OsPUL基因在整個種子發育階段高度表達，在發育的中后期達到峰值[17]。Kawagoe等[18]利用淀粉糊質的綠色熒光蛋白探究isa1突變體中的淀粉質體和淀粉顆粒的形成，發現isa1突變體的含糖胚乳中沒有淀粉顆粒，表明ISA1在淀粉顆粒形成的早期至關重要。本研究中的突變體m5788與野生型相比籽粒更加透明，淀粉顆粒明顯減少，與上述報道相似。

在水稻ISA活性降低的sug1突變系中，高活性PUL會導致淀粉區域形成α-葡聚糖而不是植物糖原[19]。PUL功能失活的玉米突變體zpu1-204中的胚乳淀粉結構和組成與野生型相比沒有顯著差異。但相較于野生型，Zpu1-204在胚乳發育過程中會積累分枝性麥芽低聚糖。表明PUL參與籽粒淀粉形成過程中的葡聚糖水解，有助于淀粉的分解代謝。ISA1功能失活突變體su1-st和zpu1-204純合子雙突變體與野生型相比，胚乳中植物糖原積累顯著[16]。Fujita等[20]研究表明，與野生型相比，在PUL突變體中，支鏈淀粉聚合度（DP）＜13的短鏈增加，但變化幅度遠小于ISA1缺陷突變體sug1，但PUL突變體的α-葡聚糖和淀粉結構基本一致。PUL/su1雙突變體保留了胚乳外層淀粉組織，但表現出比su1含量更高的可溶性多糖和更多的DP＜7短鏈。這表明PUL功能缺失對支鏈淀粉合成的影響雖小于su1，但PUL的活性對sug1表型的變化也具有一定的影響。在本研究中，m5788胚乳中的DBE途徑中的2種底物特異性酶基因OsISA1和OsPUL的表達量均顯著下降，ISA1功能損傷可能是導致突變體可溶性糖含量增加和淀粉含量下降的主要原因，而PUL對m5788表型變化也產生了一定的影響，與上述研究結果相符。但2015年趙華等[21]對Sug-11糖質突變體與其野生對照籽粒灌漿中的ISA與PUL基因的轉錄表達水平檢測結果顯示，ISA1基因的表達量并沒有明顯下降，但PUL的表達量出現了一定程度的下降。該結論與本研究有所區別，猜測可能是由于具有甜質胚乳的水稻材料不同，導致ISA1活性差異。

East等[22]于1911年在玉米中首次描述了甜質突變體su1以來，玉米中已經鑒定了許多甜質胚乳突變體，例如甜質基因sugary 1和sugary 2，超甜突變基因sh2、bt1和bt2，加強甜突變基因sel等[23]。Nakamura等[24]在玉米糖質胚乳突變體中發現，與DBE相關的ISA1基因表達活性顯著下降。隨后，通過對玉米ISA1同源性分析發現，在水稻的8號染色體上有1個它的同源ISA1。2005年，Kubo等[25]將小麥的甜質胚乳基因組導入水稻ISA1基因損傷的甜質胚乳突變體EM91中，在轉基因的T0水稻植株中，胚乳性狀恢復正常，胚乳中的可溶性糖含量降低，淀粉積累正常，證明了ISA1基因在淀粉合成過程中的作用。我們的突變體材料與報道的甜質胚乳突變體籽粒表型相似。前人研究[7,10]表明，LOC_Os08g4093中堿基替換是導致水稻甜質胚乳的遺傳基礎，而我們的試驗結果表明，LOC_Os08g40930基因組在m5788與野生型中不存在堿基差異，水稻甜質胚乳是由于ISA1表達量降低導致的，故M5788是水稻基因OsISA1的一個新的等位變異。但導致ISA1表達量降低的分子機制仍需進一步深入研究。

4 結論

通過對甜質胚乳突變體m5788的研究發現，m5788表現出株高降低、籽粒皺縮和千粒重降低等表型。突變體碘染呈淺紫色，淀粉含量減少。生理試驗表明，突變體可溶性糖含量增加是導致甜質胚乳的主要原因。對蛋白質和直鏈淀粉含量等幾個關鍵品質性狀的測定結果表明，m5788蛋白質含量增加了1.91個百分點，直鏈淀粉含量增加了0.36個百分點，脂肪酸含量增加了1.52個百分點，膠稠度降低了14.66個百分點。胚乳糖質突變對稻米品質的理化特性產生了較明顯的影響。遺傳分析表明，該性狀受1對隱形等位基因控制，突變體m5788目標基因被精細定位在水稻8號染色體上標記Z8-25.8和Z8-25.9之間物理距離為110kb的區間內。該區間含有1個已經報道的OsISA1甜質基因，編碼1個名為異淀粉酶1的淀粉去分支酶蛋白[12]。測序分析表明，OsISA1基因組序列未發生變化，但是該基因的表達量明顯降低，同時與ISA1基因功能相似的OsPUL表達量也明顯降低。綜上，突變體m5788是一個新的甜質胚乳材料，在培育功能性水稻品種中具有一定的利用價值。