玉米雜交種及其親本苗期性狀對低氮脅迫的動態響應

徐世英 王 寧 程 皓 馮萬軍

（山西農業大學農學院/黃土高原特色作物優質高效生產省部共建協同創新中心，030801，山西晉中）

雜種優勢（hybrid vigor或heterosis）是指2個遺傳背景不同的親本雜交產生的雜種F1代，在生物量、生長速率、生活力及在生物或非生物脅迫的抗性等性狀上優于親本的現象[1-2]。目前，常用于評估特定性狀雜種優勢表現的指標包括中親優勢（MPH）和超親優勢（BPH），即分別為同一性狀雜交種與親本中親值（MPV）和高親值差值的比值[3]。雜種優勢在玉米生產上已經廣泛應用，但其遺傳基礎尚不清楚。研究表明，玉米在眾多性狀上均有雜種優勢表現，如生物量或產量等成株性狀[4-6]，以及胚[7-8]和幼苗[9-10]發育早期的多個性狀。玉米幼苗初生根和種子根對幼苗早期活力起關鍵作用，因此其幼苗根系是研究雜種優勢遺傳基礎的理想材料[11]。Hoecker等[10]對12個玉米雜交種及其親本自交系研究發現，不同幼苗根系性狀的雜種優勢表現有較大差異，其中初生根長度、側根密度和種子根數等性狀優勢值較高。

雜種優勢表現與遺傳、環境和生長發育時期等眾多因素有關[12]。玉米雜交種比親本生長更快、產量更高，這可能與其具有更優異的營養環境適應能力有關[13]，也因此比親本更耐密植[14]。研究發現，在干旱脅迫下，耐旱性強的玉米雜交種及其親本體內的抗氧化酶活性升高幅度大于耐旱性弱的玉米雜交種及其親本，雜交種的耐旱性受親本的加性效應作用[15]，但隨著干旱時間推進，雜交種及其親本體內的抗氧化酶活性有一定變化，母本對雜交種的保護酶活性和抗膜脂過氧化傷害能力的影響較大[16]。在低磷脅迫下，玉米自交系幼苗體內的超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，而在雜交種中卻升高，雜交種在多個性狀上都有比親本更強的耐低磷性[17]。陳范駿等[18]研究指出，在低氮和高氮水平下，玉米雜交種的氮素利用效率（NUE）均有中親或超親優勢，且在低氮水平下玉米雜交種的NUE僅受母本影響。在不施氮的情況下，玉米雜交種在生殖生長期的氮素吸收量與總氮素吸收量的比值相較于親本顯著增加[19]。這些研究表明，在逆境下，雜交種具有比親本更好的耐受性，但雜種優勢表現因遺傳背景和逆境下生長時間不同而存在較大差異。

氮素是保證作物產量的重要礦質元素之一[20-21]。在農業生產中，由于氮肥的過量施用，作物的產量并未持續提高，并且導致一系列嚴重的環境問題[22-23]。因此，如何在減少氮肥用量的同時保證作物產量是目前農業生產面臨的主要矛盾之一，而解析作物的氮素利用機制，培育氮高效利用的作物新品種，可能是解決這一矛盾較為有效的手段[24]。目前，關于缺氮條件下雜交種及其親本苗期性狀如何進行動態響應，且苗期雜種優勢的形成是否受到影響的研究未見報道。為此，本研究采用水培法，通過設置低氮和正常供氮2個處理，測定處理不同時間后2個玉米雜交種及其親本幼苗期地上部和根系性狀，分析其雜種優勢表現的動態變化，為解析玉米雜種優勢形成機制以及氮高效玉米雜交種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

以玉米雜交種豫玉22（YY22）和先玉335（XY335）及其親本自交系[豫玉22母本綜3（Z3）、父本87-1，先玉335母本PH6WC、父本PH4CV]為試驗材料，于2020年在山西農業大學農作站經過嚴格的人工套袋授粉繁育，選取飽滿的種子在10%雙氧水中消毒30min，用蒸餾水沖洗干凈后用蒸餾水浸泡12h，后轉移到含有雙層濾紙的培養皿中，放入25℃培養箱中進行催芽，待初生根長至約1.0cm，挑選出長勢均勻的幼苗，去除胚乳后全部移植到裝有44L含1/2營養液的黑色育苗箱中，置于人工氣候室進行蹲苗處理，待第2個葉片完全展開，挑選長勢一致的幼苗，將其隨機分為2組，分別移植到盛有正常氮素（2mmol/L，CK）和低氮（0.04mmol/L，LN）水平營養液的黑色育苗箱中進行培養，3次重復。營養液配方參考趙澤群等[25]的方法，氮用Ca(NO3)2·4H2O供給，并以1.8mmol/L CaCl2·2H2O補充不足的Ca2+，營養液pH設為6.0±0.1，每天進行標定，每3d換1次營養液，同時隨機更換水培箱的位置。在幼苗培養過程中，人工氣候室晝夜光照長短及溫度分別設定為16h/8h和26℃/18℃，光照強度14 000lx，期間用電動氣泵連續通氣。分別在培養3、7和14d時，3次重復中各選取5株長勢一致幼苗用于表型和全氮含量測定。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 表型性狀 用解剖刀截取幼苗的第1（L1）和第2（L2）片葉片，用掃描儀Epson V850掃描拍照，利用ImageJ軟件分析葉面積。

將地上部與根系手動分離，根系用水清洗，把每個材料的根系放入裝有雙蒸水的有機玻璃盤（30cm×20cm）中，逐一分開側根，防止重疊，然后進行掃描。利用WinRHIZOTM軟件分析單株總根長、根體積、根表面積、根平均直徑、分枝數和根尖數等根系性狀[26]。測定完成的根系與地上部分開放置于烘箱中120℃殺青30min，80℃烘至恒重，最后稱干重。并計算根冠比，根冠比=根系干重/地上部干重。

1.2.2 生理指標 在取材當天，利用葉綠素儀（SPAD-502，Minolta Camera Co.Ltd.，日本）測定幼苗的第1葉（L1）和第2葉（L2）的相對葉綠素含量（SPAD值）。

地上部和根系樣品烘干研磨后，稱取50mg粉末，采用H2SO4-H2O2-靛酚藍比色法測定氮素濃度[27]。根據公式：氮素積累量（mg）=生物量×氮素濃度，計算地上部、根系、整株的氮素含量及地上部與根系中氮與整株氮含量之比；根據公式：耐低氮指數=低氮處理下性狀值/對照性狀值[28]，計算各性狀的耐低氮指數。

1.2.3 雜種優勢指標 用以下公式[3]計算各性狀的中親優勢和超親優勢：中親優勢（MPH，%）=[F1-雙親均值（MP）]/MP×100；超親優勢（BPH，%）=[F1-高親值（HP）]/HP×100。

1.3 數據處理

用Excel 2010進行數據整理，利用SPSS 16.0軟件對整理好的數據進行統計分析，用TBtools和Origin 2021軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 玉米雜交種及其親本幼苗葉片和根系形態對低氮脅迫的反應差異

在LN處理7d時，6個基因型的L1和L2尚未明顯衰老，但在LN處理14d時，先玉335及其親本的L1和L2均已萎蔫，且以先玉335萎蔫程度更為嚴重；而在LN處理14d時，豫玉22及其親本僅L1衰老嚴重，其L2尚未明顯衰老，且在3個基因型間差異不明顯（圖1a）。在根系形態上，LN處理3d時，豫玉22根系形態與對照相比已有明顯變化，側根數和側根長均比對照明顯增加，且在7d時這些變化更為明顯，而至14d時其生長受到抑制，但其兩親本根系在2個氮素水平處理早期（3和7d）變化并不明顯，僅87-1在LN處理14d時其根系才明顯比對照更為龐大；與之不同，先玉335及其父本PH4CV的根系形態在LN處理7d時才與對照相比有明顯變化，表現為側根的數目增加，根系更為龐大，而在LN處理14d時與CK處理相比差異不明顯，但其母本PH6WC在兩氮素水平處理間始終變化并不明顯（圖1b）。上述結果表明，玉米苗期根系對低氮的反應要早于地上部，且雜交種對低氮的反應比親本更為迅速，但這種反應在不同基因型上有較大差異，并且會隨著時間有一定變化。

圖1 2個氮素水平下玉米雜交種及其親本幼苗葉片（a）和根系（b）形態的動態變化Fig.1 Dynamic morphology changes on leaves(a)and roots(b)of seedlings among maize hybrids and their parents under two nitrogen levels

2.2 2個氮素水平下玉米雜交種及其親本幼苗性狀的方差分析

從表1可以看出，除根表面積和根體積在氮素水平上差異不顯著外，其余15個性狀在培養時間、氮素水平和基因型3個因素上均有顯著或極顯著差異，且僅根平均直徑未受到培養時間與氮素水平及3個因素間互作的顯著影響，而其余性狀在任意2個或3個因素間互作上均有顯著或極顯著差異。另外，從方差值來看，氮素水平對單株氮積累量、地上部氮積累量、葉片的SPAD值和根系氮積累量等性狀影響較大，其次是根冠比、地上部干重和根尖數，而對其余7個性狀的影響相對較小，說明不同性狀對氮素的反應有一定差異，但這種反應差異受培養時間、基因型及其相互作用的影響。

表1 2個氮素水平下不同培養時間玉米雜交種及其親本幼苗性狀的方差分析Table 1 The variance analysis of the seedling traits among maize hybrids and their parental lines at different days after two nitrogen treatments

2.3 玉米雜交種及其親本幼苗雜種優勢及聚類分析

結合雜種優勢測定結果與聚類分析（圖2）發現，2個雜交種所有性狀的中親和超親優勢在各時間點的變化趨勢基本一致，均以總根長、根表面積、根體積、根尖數、根干重、地上部干重、地上部氮素積累量、根系中氮素積累量、單株氮素積累量9個性狀在各時間點具有較大中親和超親優勢值，而L1和L2的葉面積、SPAD值、根平均直徑、根冠比、地上部和根系的氮積累量占比等8個性狀在各時間點的中親和超親優勢值相對較小，甚至個別性狀表現出負優勢，因此根據17個性狀的雜種優勢表現差異大致可以分為2組。另外，從優勢值來看，LN處理7d時，豫玉22根尖數的中親和超親優勢值最大，分別達到了413.5%和401.2%，其次是CK處理7d的豫玉22的總根長和根表面積，其總根長中親和超親優勢值分別為383.3%、365.5%，根表面積為342.3%、323.0%；豫玉22其余性狀在CK處理7d的中親優勢在-38.2%（7d根系氮素積累量占比）～383.3%（7d總根長），LN處理中親優勢值7～14d在-19.6%（14d的L2的SPAD值）～413.5%（7d根尖數），CK處理7d的超親優勢值為-52.4%（7d根系氮素積累量占比）～365.5%（7d總根長），LN處理7d和14d的超親值為-27.3%（14d的L2的SPAD值）～401.2%（7d根尖數）；而先玉335所有性狀在CK處理不同時間的中親優勢則在-28.7%（3d的根系氮素積累量占比）～171.8%（14d的地上部氮素積累量），而LN處理14d時中親優勢值在-71.3%（14d的L2的葉面積）～171.7%（14d的總根長），CK處理3d和14d超親優勢值為-35.4%（3d的根系氮素積累量占比）～129.1%（14d的地上部氮素積累量），LN處理的超親優勢值為-82.7%（14d的L2葉面積）～158.7%（14d總根長）（圖2）。

圖2 2個氮素水平處理不同天數后玉米幼苗各性狀中親（a）和超親（b）優勢的聚類Fig.2 Cluster of the mid-parent(a)and better-parent(b)heterosis of all traits of maize seedlings at different days after two nitrogen level treatments

由圖2可以看出，相比于CK處理，在LN處理下2個雜交種有一些性狀的中親和超親優勢值均升高或降低。其中，在LN處理3d時，先玉335的根體積、總根長、根表面積、根尖數和總氮積累量的增加幅度在11.9%～46.8%，而豫玉22的L1和L2的葉面積、根尖數、根干重、根冠比、地上部氮積累量、根系氮積累量、單株氮積累量及根系氮積累量占比的中親和超親優勢均升高，增加幅度在11.2%～230.5%；LN處理7d時，先玉335的根體積、總根長、根表面積、地上部干重和根系氮積累量占比的中親和超親優勢值均提高，增加幅度在12.3%～100.0%，而豫玉22的根系氮積累量、根系氮積累量占比、地上部干重和根尖數的中親和超親優勢值均升高，增加幅度在為49.4%～229.0%；LN處理14d時，先玉335的總根長、根尖數、根表面積和L1葉面積的中親和超親優勢值均提高，增加幅度在14.7%～109.1%，而豫玉22的總根長、根表面積、根體積、根尖數、根冠比、根系氮積累量占比的中親和超親優勢值均升高，增加幅度在10.8%～191.6%。由此表明，豫玉22的根尖數、根系氮積累量占比和先玉335的總根長、根表面積及根尖數的中親和超親優勢值在3個時間點均比CK有所升高；而在LN處理下，豫玉22的地上部氮積累量和先玉335的葉面積的中親和超親優勢在3個時間點均比CK有所降低。

綜上，在CK和LN處理下，雜交種幼苗的多個性狀均存在中親和超親優勢，且低氮對玉米幼苗的雜種優勢表現有一定影響，多個根系性狀及其根系中的氮素含量的雜種優勢在LN處理下會提高，而葉面積和地上部氮素積累量的雜種優勢則會降低，但這種差異表現會因性狀、培養時間和雜交組合不同而存在較大變化，由此表明雜種優勢的遺傳機制異常復雜。

2.4 玉米雜交種及其親本幼苗性狀耐低氮性分析

對各性狀的耐低氮指數分析（表2）發現，隨著脅迫時間推進，17個性狀的耐低氮性上，地上部干重、L1和L2的葉面積和SPAD值、地上部氮積累量、根系氮積累量和總氮積累量呈遞減的變化，根冠比和根系氮積累量占比呈遞增趨勢，總根長、根表面積、根體積、根平均直徑、根尖數和根干重先升高后降低，而地上部氮積累量占比則先保持不變后有所降低。同時，基于3個時期和所有基因型，除根平均直徑和地上部氮積累量占比整體的變異系數較小以外，其余性狀的變異系數均在20.2%～75.0%。另外，隨著脅迫時間推進，6個基因型在所有性狀上的變異系數呈逐漸升高的變化，說明培養時間對各性狀的耐低氮性的影響較大。

表2 不同培養時間玉米雜交種及其親本幼苗耐低氮指數Table 2 Low nitrogen tolerance indexes of seedling among maize hybrid and their parents at different days after cultivation

基于各性狀的耐低氮指數的平均值，對3個時間點下6個玉米基因型幼苗的耐低氮性進行分析發現，在處理3d時，除綜3耐低氮性較差外，其余5個基因型的整體耐低氮性差異不大；在7d和14d，6個玉米基因型的耐低氮性的排序分別為：87-1＞先玉335≥PH4CV＞綜3≥豫玉22＞PH6WC和PH4CV＞先玉335＞87-1≥豫玉22＞PH6WC＞綜3（表2）。綜合3個處理時間的結果可以看出，6個基因型的材料耐低氮性依次為87-1（1.02）＞PH4CV（0.99）＞先玉 335（0.98）＞豫玉 22（0.92）＞PH6WC（0.87）＞綜3（0.82）。由此表明，6個基因型玉米的耐低氮能力隨著時間推進會發生變化，而各時間點下雜交種的耐低氮能力在2個親本之間或與其中1個親本接近。

2.5 基于耐低氮指數對各性狀間的相關性分析

相關性分析（表3）表明，根尖數的耐低氮指數與總根長、根表面積、根系氮積累量和單株氮積累量等性狀的耐低氮指數呈顯著或極顯著正相關；而根冠比的耐低氮指數與根系氮積累量占比的耐低氮指數呈極顯著正相關，但與L1和L2的SPAD值、地上部干重、地上部氮積累量、單株氮積累量、地上部氮積累量占比等性狀的耐低氮指數呈顯著或極顯著負相關。結果表明，低氮下，側根數目的增加有助于吸收有限的氮素資源，而根系中分配的氮素越多，越有利于促進根系生長，從而造成根冠比增大。

表3 不同性狀耐低氮指數的相關性分析Table 3 Correlative analysis of low nitrogen tolerance indexes of the different traits

3 討論

雜種優勢是復雜的數量性狀，是整個作物生長周期中各雜種優勢性狀相互作用的結果[13]。Springer等[12]總結前人研究發現，不同雜交組合同一性狀的雜種優勢不一致，同一組合不同性狀的雜種優勢也不相同，在研究的眾多成株性狀中以產量和穗粒重的超親優勢值較大，均在60%以上。玉米幼苗期對環境非常敏感，是研究其對逆境響應機制的理想時期[29]。研究[9]表明，不同玉米雜交組合發芽后3～7d初生根長度的中親優勢值在17%～25%，而側根密度的中親優勢值變化范圍為51%～130%。水培8d的玉米雜交種幼苗根系在總長度、表面積、體積、根尖數和干重等性狀上，中親和超親優勢均分別在60%和30%以上[26]。本研究中，在相同氮素水平下，豫玉22和先玉335在水培3、7和14d時，均以總根長、根表面積、根體積、根尖數和根干重等根系性狀及地上部和根系的氮素積累量的中親和超親優勢值較大，多數均在50%以上，而葉片面積和葉綠素含量等地上部性狀的中親和超親優勢值較小，多數均在30%以下，甚至有些性狀存在負優勢，這與前人研究[9,12,26]結論相近。

雜種優勢受環境和發育時期雙重影響[5-6]。在鹽脅迫下，雜交種的膜穩定性和葉綠素含量均高于親本，而超氧自由基和Na+含量均低于親本，說明雜交種在耐鹽脅迫上存在雜種優勢[30]。Betrán等[31]研究指出，低氮會造成玉米產量的雜種優勢表現低于正常環境。本研究發現，在低氮脅迫早期（3d和7d），在雜種優勢表現上，玉米雜交種先玉335的總根長、根表面積、根平均直徑和根體積等性狀均高于對照，但其根尖數和根冠比則先后低于對照；而豫玉22僅根干重和根尖數高于對照，但其總根長、根表面積、根平均直徑和根體積均低于對照。在低氮脅迫后期（14d），2個雜交種的根冠比、總根長、根表面積和根尖數的中親優勢和超親優勢值均高于對照，先玉335的根干重、根平均直徑和根體積的中親優勢和超親優勢值均低于對照，而豫玉22僅根干重的超親優勢值低于對照。由此表明，氮素對玉米幼苗雜種優勢的形成有一定影響，且低氮下各個性狀的雜種優勢表現還會隨脅迫時間及基因型的不同而有所改變，低氮會提高一些苗期根系性狀的雜種優勢，而也有些苗期根系性狀的雜種優勢形成受低氮抑制。

根系是植物首先感知土壤中水分和礦質元素的器官，對氮素的反應早于地上部[32]。植物的根系對氮素表現出很強的可塑性，可以通過改變根系構型和增大根冠比來適應不同的氮素環境[33]。一般短期缺氮會促進根系生長，而高氮則抑制根系生長[34]。氮素缺乏會促使側根大量發生，增大根表面積和根體積，從而有利于對水分和營養元素的吸收[35-36]。本研究發現，隨著脅迫時間推進，6個基因型玉米根冠比的耐低氮指數從1.02增至2.23，且2個雜交種根冠比的耐低氮指數均與其母本接近，說明低氮導致玉米幼苗根冠比增加，玉米雜交種幼苗根冠比對低氮的響應可能受母體遺傳。在根尖數上，在脅迫處理3d和7d時，僅豫玉22及其父本87-1的耐低氮指數在1.0以上，這意味著這2個基因型玉米側根數目在低氮脅迫下有所增加；另外，僅在脅迫處理14d時，玉米雜交種先玉335的耐低氮指數介于雙親之間，其余2個時間點下均高于任一親本，而雜交種豫玉22則在任一時間點均高于其雙親，這與表型觀察結果基本一致（圖1和表3），表明玉米雜交種幼苗側根數目對低氮的響應可能多受加性或顯性效應作用。

氮素調動的變化通常伴隨著植株表型性狀的改變[19]。研究[25]發現，相比于正常氮素水平，當氮素匱乏時，玉米幼苗根系吸收的氮素在根系中的分配比例大于地上部，甚至氮高效型玉米自交系XY4在根系中的氮素積累量顯著高于對照，其根系構型更為龐大，從而保障玉米幼苗的根系生長。在本研究中，在低氮脅迫3、7和14d，玉米雜交種豫玉22的根系氮素積累量占比的耐低氮指數均在1.0左右，這意味著其在2個氮素水平間差異較小，但其2個親本的根系氮素積累量占比相比于對照均有不同程度降低；隨著脅迫時間延長，先玉335及其親本的根系氮積累量占比相比于對照均不斷提高，且在脅迫處理7d和14d時，先玉335的根系氮積累量占比均高于其雙親。由此表明，低氮脅迫下，氮素在玉米幼苗根系中的分配比例會提高，雜交種在根系中分配的氮素要遠多于其親本，從而提高其多個根系性狀的雜種優勢表現，但這些根系性狀對低氮的響應會因遺傳背景不同而有較大差異。

4 結論

氮素缺少的早期，玉米幼苗將氮素優先積累在根系中，促進側根的發生，保證根系生長，根冠比增大，有利于對有限氮素資源的有效吸收。玉米雜交種與其親本相比，具有更強的氮素平衡能力，多個根系性狀存在明顯差異，其中側根數目對低氮的響應可能受加性或顯性效應作用，根冠比對低氮的響應可能受母體遺傳，但眾多根系性狀的雜種優勢表現對低氮的響應會因遺傳背景、生長發育時間的不同而存在較大差異。因此，若想深入研究玉米在氮素利用上的雜種優勢機制，還應充分考慮這些影響因素，首先應清楚親本自交系的遺傳背景，然后分析各性狀對低氮的響應差異，而在氮高效雜交種選育過程中應注意親本間各性狀的優勢互補。