外源SLs和納米K2MoO4對干旱脅迫下油菜種子萌發的影響

龐星月 萬 林 李 素 王宇航 劉 晨 肖曉璐 李心昊 馬 霓

（中國農業科學院油料作物研究所/農業農村部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，430062，湖北武漢）

油菜是我國第一大油料作物，年種植面積達600萬hm2以上，其中長江流域約占85%[1]，近年來以直播種植方式為主[2]。然而南方秋冬季節干旱頻繁，油菜播種后容易出現出苗慢、出苗不齊、冬前弱苗和死苗等現象，難以實現壯苗齊苗，導致油菜籽產量和種植效益下降，影響了農民的種植積極性，產生大量的冬閑田[3-4]。因此，解決干旱脅迫下油菜種子萌發和出苗困難等問題，對擴大油菜種植面積、減少冬閑田、提高我國食用油供給能力具有重要意義。

獨腳金內酯（SLs）是一組類胡蘿卜素衍生的倍半萜激素，可誘導寄生性雜草的種子萌發[5]，在調控植物對生物和非生物脅迫的反應中發揮著重要作用[6]。Van等[7]研究證明，在擬南芥中，SLs是植物對非生物脅迫（如鹽和干旱脅迫）的正向調節因子。在鹽脅迫條件下，外源SLs可以增加油菜葉片抗氧化物酶活性，降低活性氧含量，促進油菜幼苗生長[8]。并且SLs能顯著提高干旱脅迫下谷子發芽率和抗旱指數[9]。萬林等[10]研究發現，0.18μmol/L SLs處理能加快干旱條件下油菜葉綠素合成，提高葉片抗氧化能力，有效增強油菜苗期抗旱性。

納米材料具有獨特的物理及化學特性[11]，與傳統化學藥劑相比，更安全高效且不易產生抗藥性，被廣泛應用于納米農藥、種子包衣劑和納米肥料等農業生產中[12]。姜余梅等[13]發現，適當濃度的碳納米管可以促進水稻種子發芽和根系生長，可提高根系活力。外施富勒烯對油菜種子萌發有顯著促進作用[14]。納米鉬酸鉀（n-K2MoO4）作為一種新型納米材料，近年來，在金屬防銹顏料、化學催化、抗菌材料、電極電池材料、熒光材料、阻燃抑煙劑及閃爍探測等方面已有良好應用[15]，本團隊前期研究認為n-K2MoO4可以增加油菜對菌核病的抗性，提高產量，且與農藥混合配施能提高藥效（未發表）。因此，為促進2種物質在油菜生產上的應用，本研究采用添加外源SLs和n-K2MoO4處理，比較干旱脅迫下油菜種子萌發過程中形態和生理指標的變化規律，探討調控種子萌發和抗旱性的生理機制，為油菜栽培技術和產品研發轉化奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料是甘藍型油菜品種Q2（抗旱型）和秦優8號（干旱敏感型），分別由中國農業科學院油料作物研究所和咸陽市農業科學院提供。SLs類似物GR24（純度≥98%）購于上海翊圣生物有限公司。

1.2 試驗方法

挑選大小一致、形態飽滿的種子，用75%酒精消毒10s，5%次氯酸鈉消毒5min，蒸餾水漂洗數次，用濾紙吸干水分。將消毒后的種子置于鋪有3層濾紙、直徑為90mm的玻璃培養皿內。每皿60粒種子，每個處理3個培養皿，3次重復，加入6mL處理液。用聚乙二醇6000（PEG）模擬干旱脅迫，根據SLs、n-K2MoO4和SLs+n-K2MoO4各4個濃度梯度的預試驗結果，分別設置處理液為蒸餾水（CK1），15% PEG（CK2），0.10μmol/L GR24+15% PEG（T1），0.24mmol/Ln-K2MoO4+15% PEG（T2），0.10μmol/L GR24+0.24mmol/L n-K2MoO4+15% PEG（T3），SLs和n-K2MoO4溶于15% PEG溶液中。將培養皿放到人工氣候箱（三洋MLR-350）中，在光照/黑暗25℃16h/20℃8h、濕度70%條件下發芽。每2d更換底部濾紙，加入各處理液5mL。試驗重復多次，7d后取樣測定幼苗農藝性狀和生理指標。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 發芽率、發芽指數和活力指數 每天觀察并統計供試材料發芽情況，以胚根長度不小于種子直徑一半作為發芽標準。以幼莖直立，子葉平展，子葉由淡黃轉為綠色為出苗標準。各指標計算方法[14]如下：發芽率（germination rate，GR，%）=發芽數/供試種子數×100；平均發芽時間（mean germination time，MT）=∑(ni×di/n)，式中，ni為第i天發芽種子數，di為開始播種天數，n為發芽的種子總數；發芽指數（germination index，GI）=(n1/1)+(n2/2)+…(ni/i)，式中，n1，n2，…，ni為第1，2，…，i天發芽數量；活力指數（vigour index，VI）=發芽率×（根長+胚芽長）。

1.3.2 胚根長、側根數及干重 發芽7d后取長勢一致的10棵幼苗，分別測定苗高、胚根長和側根數。測量完后將子葉和胚根放入烘箱中，105℃殺青30min，80℃烘干至恒重，稱地上和地下干重。所有性狀取10個幼苗的平均值。

1.3.3 葉綠素含量 采用分光光度法測定幼苗葉片葉綠素含量，葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和類胡蘿卜素分別在665、649和470nm有最大吸收峰。取0.2g葉片，用95%乙醇提取油菜葉片葉綠素，根據分光光度計測定的吸光值，計算葉綠素含量[16]。

1.3.4 生理指標 幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O-2·）、脯氨酸（Pro）和可溶性糖（SS）含量均由北京索萊寶科技有限公司的相應試劑盒測定，每個指標重復3次。SOD、POD和MDA測定試劑盒所用提取液為同一種，可同時測定。以上測量指標所用樣品質量分別為0.1g，測定步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel 2007錄入數據和計算，利用SigmaPlot 10.0軟件繪圖，SPSS 17.0軟件進行數據的單因素方差分析（One-way ANOVA）和相關性分析（pearson correlation coefficient），采用LSD法測驗α＜0.05水平上的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫和生長調節物質對油菜種子萌發性狀的影響

由表1可知，與CK1處理相比，干旱脅迫（CK2）顯著降低了秦優8號種子GR，使2個品種的種子發芽時間增加。CK2處理Q2和秦優8號的GR、GI、VI與對照（CK1）比均有所降低。CK2處理下，Q2種子GR、GI、VI和出苗率分別比CK1處理降低了1.11%、47.50%、90.02%和63.63%；秦優8號相應指標分別降低了59.33%、85.45%、96.36%和82.76%。干旱脅迫（CK2）下，Q2的GR、GI、VI和出苗率均顯著高于秦優8號。

表1 干旱和SLs、n-K2MoO4對干旱脅迫下油菜種子萌發性狀的影響Table 1 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on the germination traits of rapeseed under drought stress

外源SLs和n-K2MoO4處理后種子GR、GI和VI明顯高于CK2處理（表1），其中T3處理促進種子出苗效果最好，Q2種子GR、GI、VI和出苗率比CK2處理分別提高1.12%、65.97%、268.79%和114.03%；秦優8號的T3處理比CK2處理分別提高143.15%、512.78%、1027.13%和196.58%。

2.2 干旱脅迫和生長調節物質對油菜幼苗農藝性狀的影響

由表2可知，PEG脅迫使Q2和秦優8號的干重、主根長、側根數和側根長與CK1處理相比均有降低。Q2種子幼苗干重、主根長、側根長和側根數分別比CK1處理（正常條件）降低了17.57%、81.08%、84.20%和75.00%；秦優8號相應指標分別降低了20.65%、71.05%、92.36%和85.71%，差異均達到顯著水平（P＜0.05）。

表2 干旱和SLs、n-K2MoO4對干旱脅迫下油菜幼苗農藝性狀的影響Table 2 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on the agronomic traits of rape seedlings under drought stress

T1、T2和T3處理下2個品種的種子主根長、側根數及幼苗生長勢均與CK2（干旱脅迫）有顯著性差異。T1處理下，Q2的干重、主根長、側根長和側根數分別比CK2處理提高了47.07%、774.29%、183.04%和400.00%；秦優8號相應指標分別比CK2處理提高了27.57%、430.24%、1021.88%和1000.00%，差異均達到顯著水平（P＜0.05）。

2.3 干旱脅迫和生長調節物質對幼苗葉片葉綠素含量的影響

由表3可知，大部分干旱處理顯著降低了油菜葉片的葉綠素含量。Q2的Chl a、Chl b、Chl a+b和Chl a/Chl b的降低率分別為19.15%、12.73%、17.03%和7.39%；秦優8號分別為19.32%、16.62%、18.33%和3.51%。干旱脅迫下，外源SLs和n-K2MoO4顯著降低了葉綠素含量的降低幅度，其中T2處理的作用更明顯，Q2的Chl a、Chl b、Chl a+b和Chl a/Chl b分別增加了39.06%、23.18%、33.54%和12.77%；秦優8號分別為45.52%、44.11%、44.87%和3.64%，差異均達到顯著水平（P＜0.05）。

表3 干旱和SLs、n-K2MoO4對干旱脅迫下油菜葉片葉綠素含量的影響Table 3 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on chlorophyll content of rape seedlings under drought stress mg/g FW

2.4 干旱脅迫和生長調節物質對油菜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

如圖1所示，干旱脅迫提高了SOD和POD活性，與CK1處理相比，Q2幼苗葉片SOD和POD活性分別提高了14.03%和193.33%，秦優8號分別提高了11.53%和51.29%。在15% PEG中加入SLs、n-K2MoO4的處理能顯著提高這2種酶的活性，T1處理與CK2處理相比，Q2幼苗葉片SOD和POD活性分別增加了21.44%和58.00%；秦優8號SOD和POD活性分別增加了26.50%和44.23%。T2與CK2處理相比，Q2中SOD和POD活性分別增加了22.81%和37.69%；秦優8號中SOD和POD活性分別增加了15.72%和45.63%。T3與CK2處理相比，Q2中SOD和POD活性分別增加了38.78%和36.69%；秦優8號中SOD和POD活性分別增加了33.52%和324.04%。

圖1 干旱和SLs、n-K2MoO4處理對油菜葉片SOD和POD活性的影響Fig.1 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on the SOD and POD activities of oilseed rape leaves

2.5 干旱脅迫和生長調節物質對油菜幼苗葉片活性氧含量的影響

由圖2可知，15% PEG顯著提高了油菜子葉中的活性氧含量，與對照處理相比，Q2子葉中O-2·、H2O2和MDA含量分別上升了91.62%、49.86%和517.42%，秦優8號分別上升了192.18%、48.56%和559.62%。在15% PEG中加入SLs、n-K2MoO4的處理顯著降低了O-2·的含量，T1與CK2處理相比，Q2的O-2·、H2O2和MDA含量分別減少了37.73%、16.10%和23.10%；秦優8號中三者含量分別減少了56.14%、21.04%和62.89%。T2與CK2處理相比，Q2中O-2·、H2O2和MDA含量分別減少了34.49%、21.06%和31.92%；秦優8號中三者含量分別減少了46.20%、10.37%和49.69%。T3與CK2處理相比，Q2中O-2·、H2O2和MDA含量減少了40.81%、14.82%和74.11%；秦優8號中三者含量分別減少了54.01%、23.52%和75.22%。

圖2 干旱和SLs、n-K2MoO4處理對油菜葉片活性氧含量的影響Fig.2 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on the active oxygen contents of oilseed rape leaves

2.6 干旱脅迫和生長調節物質對油菜幼苗葉片滲透調節物質含量的影響

與正常處理相比，滲透脅迫提高了葉片中SS和Pro含量（圖3），Q2分別增加了79.34%和674.31%；秦優8號分別增加了10.34%和348.05%。SLs、n-K2MoO4處理提高SS和Pro含量，T1與CK2處理相比，Q2葉片中SS和Pro含量分別提高了20.64%和57.93%；秦優8號葉片中SS和Pro含量分別提高了42.67%和197.81%。T2與CK2處理相比，Q2葉片中SS和Pro含量分別提高了38.07%和48.28%；秦優8號葉片中SS和Pro含量分別提高了22.62%和158.73%。T3與CK2處理相比，Q2葉片中SS和Pro含量分別提高了63.35%和157.03%；秦優8號葉片中SS和Pro含量分別提高了21.75%和292.15%。

圖3 干旱和SLs、n-K2MoO4處理對油菜葉片SS和Pro含量的影響Fig.3 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on soluble sugar and proline contents of rape leaves

2.7 干旱脅迫下種子萌發相關指標與幼苗生理指標相關性分析

由表4可知，種子萌發相關指標中GR、GI、VI與DW之間存在極顯著或顯著正相關，與平均發芽時間為極顯著負相關（P＜0.01）。種子萌發相關指標（GR、GI和VI）與 MDA、H2O2和 O-2·之間存在極顯著負相關（P＜0.01）。Pro和SS含量與DW、SOD、POD活性為顯著或極顯著正相關，但和LRL為極顯著負相關（P＜0.01）。

表4 種子萌發相關指標與幼苗生理指標的相關系數Table 4 Correlation coefficients between seed germination parameters and physiological indexes in seedlings

3 討論

種子萌發是植物生長過程中的起始階段，也是保證出苗的前提[17]。而干旱會常造成油菜種子發芽延緩、生長緩慢和干物質積累減少[18-19]。作物萌發期干旱常用高滲溶液模擬，如聚乙二醇、甘露醇和蔗糖等，15%濃度以上的PEG能顯著抑制作物種子發芽率、發芽指數及幼苗生物量[20]。胡承偉等[21]發現，14% PEG滲透脅迫明顯抑制油菜根鮮重和側根數目。這些與本研究結果一致。另外，本研究發現干旱脅迫嚴重影響根長生長，而且抗旱性品種Q2在干旱脅迫下具有較高的GR、GI和VI。

MDA是膜脂過氧化的主要產物之一[22]，可作為植物細胞膜損傷程度的指標[23]。干旱脅迫在細胞水平上顯著加速ROS的生成[24-26]，ROS的自由基主要包括O-2·、過羥基自由基（HO2）和烷氧自由基（RO），而H2O2和單線態氧（O2）則以非自由基的分子形式存在[27-28]。本萌發試驗結果表明，干旱脅迫下，與正常供水相比，Q2子葉中MDA和O-2·含量上升幅度低于秦優8號，說明抗旱油菜品種受干旱傷害較輕。SOD是超氧化物的主要清除劑，產生H2O2，由POD通過酚類化合物或抗氧化劑分解H2O2[28-29]，從而提高植物抗旱能力。本研究在干旱處理后，2個油菜品種SOD和POD活性顯著上升。Pro和SS通過降低細胞滲透勢來維持細胞膨壓，防止細胞脫水，減輕逆境對細胞的傷害[30]。本研究結果表明干旱處理后抗旱品種Q2的Pro和SS含量較高。

SLs可以促進種子萌發，調控根系構型，增加根毛長度，促進次生生長[31-32]，外施SLs可顯著緩解上述干旱脅迫對植物造成的傷害。納米材料因獨特的物理和化學特性廣泛應用于植物生產中，可刺激植物生長，改善植物的生長環境，促進植物代謝[33]。本研究中SLs和n-K2MoO4分別處理以及SLs+n-K2MoO4處理顯著緩解了干旱對敏感品種油菜種子萌發的抑制，尤其是SLs+n-K2MoO4對油菜種子GR的促進作用最大。而本研究中SLs+n-K2MoO4互作對種子根長和側根數的促進作用小于SLs和n-K2MoO4各自處理，其作用機制需要進一步研究。

Mojde等[32]發現，SLs處理的植物對干旱脅迫有較強的耐受性，具有較高的抗氧化物酶活性和滲透調節物質。納米材料可促進逆境脅迫下植物SOD、POD和CAT活性升高[33]。本研究中，SLs、n-K2MoO4處理后各油菜品種 MDA、H2O2、O-2·含量都顯著下降，說明SLs和n-K2MoO4對干旱造成的MDA、H2O2和O-2·含量升高具有抑制作用，SLs和n-K2MoO4可以緩解干旱對油菜幼苗傷害。另外，SLs和n-K2MoO4提高油菜幼苗SOD、POD活性和SS、Pro含量，也從側面說明油菜幼苗抗旱性有所增強。其中0.10μmol/LGR24+0.24mmol/Ln-K2MoO4對SOD和POD活性的促進作用以及對MDA含量的抑制效果更加明顯。

4 結論

抗旱品種Q2在干旱脅迫后種子GR、GI、VI、出苗率、芽長及SOD、POD活性、SS、Pro含量高于干旱敏感型品種秦優8號，MDA、H2O2、O-2·含量低于秦優8號。SLs、n-K2MoO4對干旱引起的種子出苗率低和幼苗生長慢等現象均有一定的緩解作用，SLs主要促進種子根系生長和側根分化，n-K2MoO4主要增加了葉片葉綠素含量，而SLs+n-K2MoO4處理對干旱脅迫下種子萌發出苗和緩解細胞氧化損傷的效應較好。