H2O2對(duì)吸脹冷害下花生種子萌發(fā)的影響

崔亞男 張 曼 張朋磊 劉 兵 郝 西 臧秀旺

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，450002，河南鄭州）

花生（Arachis hypogaea L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物，也是我國(guó)食用蛋白和食用植物油的重要來(lái)源[1-2]。花生是一種喜溫作物，在我國(guó)黃淮海流域早春播種的花生遇到低溫天氣時(shí)易出現(xiàn)出苗不齊和苗弱小的現(xiàn)象。種子在發(fā)芽過(guò)程中，根據(jù)吸水速率、發(fā)芽時(shí)間及后期生長(zhǎng)可分為3個(gè)階段，分別為吸脹階段、吸水變慢并達(dá)到頂峰時(shí)期以及發(fā)芽后期，其中吸脹階段對(duì)低溫脅迫最為敏感[3-4]。喜溫農(nóng)作物種子若在吸脹期遇到0℃～12℃低溫，常發(fā)生吸脹冷害[5]，此時(shí)的種子活力降低，出苗率和成苗率下降。種子吸脹冷害在多種農(nóng)作物上發(fā)生，已成為全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的重要問(wèn)題之一[6]。因此，研究花生種子萌芽期抗寒的調(diào)控技術(shù)和耐寒生理機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)花生及其他農(nóng)作物的生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)意義。

過(guò)氧化氫（H2O2）是植物體內(nèi)各種生理代謝的副產(chǎn)品，當(dāng)植物受到非生物和生物脅迫時(shí)，它的含量迅速升高，過(guò)量H2O2會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，而適宜濃度的H2O2可作為信號(hào)物質(zhì)調(diào)控植物體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)以及減輕逆境帶來(lái)的傷害[7-8]。朱利君等[9]研究發(fā)現(xiàn)，用0.3% H2O2對(duì)黃瓜浸種可介導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)，調(diào)控脫落酸（ABA）和赤霉素（GA）的含量來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用。張曼等[10]研究發(fā)現(xiàn)，利用0.05% H2O2浸種能誘導(dǎo)油菜種子抗寒基因的表達(dá)和提高酶活性，達(dá)到促進(jìn)種子萌發(fā)的作用。耶興元等[11]研究表明，H2O2通過(guò)調(diào)控抗氧化酶系統(tǒng)增強(qiáng)草莓苗的抗冷性。張美華[12]研究表明，H2O2通過(guò)調(diào)控玉米的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可減弱低溫對(duì)玉米萌發(fā)的影響。然而H2O2浸種對(duì)花生的萌芽及調(diào)控萌芽期的生理機(jī)制的影響研究仍不完善。

本研究以當(dāng)前河南省主推花生品種豫花9326和豫花37為材料，研究H2O2浸種對(duì)吸脹冷害下花生品種的露白率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率等發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)和膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及內(nèi)源激素含量的影響，探究H2O2浸種對(duì)吸脹冷害下花生種子萌發(fā)的影響和促進(jìn)種子萌發(fā)的生理機(jī)制，為研發(fā)花生萌芽期耐寒性的調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以高油花生品種豫花9326和高油酸花生品種豫花37為材料，材料均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。豫花9326的基本性狀為普通大果型、直立疏枝、連續(xù)開(kāi)花、籽仁含油量56.67%、油酸含量36.6%；豫花37的基本性狀為珍珠豆型、直立疏枝、連續(xù)開(kāi)花、籽仁含油量55.96%、油酸含量77.0%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用智能人工氣候箱（寧波萊福科技有限公司，型號(hào)：FPG3型）進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果（未發(fā)表），H2O2浸種濃度選用50mmol/L，低溫（5℃）浸種48h是參照唐月異等[13]的試驗(yàn)方法略加改動(dòng)。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理，分別為低溫（5℃）滅菌水浸種（CK）和低溫50mmol/L H2O2浸種（A1），每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.1 種子消毒與浸種 每個(gè)重復(fù)挑選大小一致、飽滿(mǎn)的種子30粒，稱(chēng)重記錄，種子用0.5%次氯酸鈉消毒5min，期間不斷攪拌，消毒后的種子用無(wú)菌水沖洗3遍。在5℃黑暗條件下，將消毒后的種子分別在滅菌水和50mmol/L H2O2中浸泡48h。

1.2.2 種子萌發(fā) 浸種結(jié)束后，將種子放入鋪有2層無(wú)菌水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)6d，期間每天調(diào)查萌發(fā)和發(fā)芽數(shù)，計(jì)算第4天的發(fā)芽勢(shì)和第6天的發(fā)芽率，并注意觀察補(bǔ)充滅菌水。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 種子浸出液電導(dǎo)率 浸種結(jié)束后，用電導(dǎo)率儀[梅特勒-拖利多儀器（上海）有限公司，型號(hào)：S230]測(cè)定各處理種子浸出液電導(dǎo)率。電導(dǎo)率的計(jì)算公式如下：電導(dǎo)率[μS/(cm·g)]=（處理液測(cè)定值-空白對(duì)照測(cè)定值）/種子干重。

1.3.2 種子發(fā)芽相關(guān)指標(biāo) 將胚根突破種皮視為露白，胚根≥2mm視為發(fā)芽。計(jì)算各處理的露白率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率以及發(fā)芽指數(shù)。相關(guān)公式如下：露白率（%）=（露白種子數(shù)/種子總數(shù)）×100，發(fā)芽勢(shì)（%）=（第4天的發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)）×100，發(fā)芽率（%）=（第6天的發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)）×100，發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt），其中Gt為第t天種子的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)。

1.3.3 生理指標(biāo)及激素含量 為進(jìn)一步探究H2O2浸種促進(jìn)吸脹冷害下花生種子萌發(fā)的生理機(jī)制，在萌發(fā)的第0、4、6天測(cè)定了豫花9326種子的丙二醛（MDA）、可溶性糖、可溶性蛋白及內(nèi)源激素含量。在發(fā)芽的第0、4、6天，挑選各處理長(zhǎng)勢(shì)均勻的種子分別放入液氮中快速冷凍，然后放-80℃超低溫冰箱保存，采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒（微量法）測(cè)定MDA、可溶性糖、可溶性蛋白、ABA及GA含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2007和SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析和作圖。利用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2浸種對(duì)種子電導(dǎo)率的影響

由圖1可知，與CK處理相比，A1處理降低了2個(gè)花生品種的電導(dǎo)率，豫花9326降低幅度更大。豫花9326和豫花37處理組的電導(dǎo)率分別為2.67和4.57μS/(cm·g)，較對(duì)照組分別降低了47.67%和23.67%，差異均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。

2.2 H2O2浸種對(duì)花生種子露白率的影響

由表1可知，萌發(fā)第3天CK處理下豫花9326和豫花37的露白率分別為75.76%和66.67%，A1處理分別為96.97%和85.71%，比CK處理分別提高了28.00%和28.56%，差異均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。萌發(fā)第6天豫花9326的CK和A1處理露白率分別為89.39%和96.97%，A1處理比CK處理提高了8.48%，豫花37的CK和A1處理露白率均為92.06%。由此可知，H2O2浸種能提高吸脹冷害下2個(gè)花生品種的露白率。

2.3 H2O2浸種對(duì)花生種子發(fā)芽特性的影響

由表2可知，與CK處理相比，A1處理的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均有所提高。其中豫花9326的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別提高了31.25%、18.52%和50.53%。與CK處理相比，A1處理下豫花37的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別增加了14.58%、3.64%和36.13%。經(jīng)方差分析，豫花9326的對(duì)照組和處理組，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的差異均達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），發(fā)芽率的差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）；豫花37發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率差異均不顯著（P＞0.05），發(fā)芽指數(shù)差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。綜上可知，H2O2浸種處理可提高吸脹冷害下豫花9326和豫花37的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。

表2 H2O2浸種對(duì)花生種子發(fā)芽特性的影響Table 2 Effects of H2O2soaking treatments on the germination characteristics of peanut seed

根據(jù)電導(dǎo)率值、萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)可以得出，在吸脹冷害下，H2O2浸種處理能提高種子的發(fā)芽能力，其中豫花9326更能響應(yīng)H2O2這種促進(jìn)發(fā)芽作用。

2.4 H2O2浸種對(duì)花生種子MDA含量的影響

由圖2可知，隨萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，CK處理的MDA含量不斷增加，與第0天相比，第4和6天的MDA含量均顯著提高，其中第6天的MDA含量增加了44.27%。A1處理下MDA含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，與CK處理相比，A1處理第0、4、6天MDA的含量分別降低了0.22%（P＞0.05）、7.05%（P＜0.05）和32.55%（P＜0.05）。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果可知，在萌發(fā)的過(guò)程中，A1處理的MDA含量均低于CK處理。

圖2 H2O2浸種對(duì)花生種子MDA含量的影響Fig.2 Effects of H2O2soaking treatments on MDA content of peanut seed

2.5 H2O2浸種對(duì)花生種子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

如圖3a所示，在種子萌發(fā)第0天，即低溫浸種結(jié)束時(shí)，A1處理的可溶性糖含量顯著高于CK處理（P＜0.05）。隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，CK處理和A1處理可溶性糖含量均有所增加，但A1處理均高于CK處理。在萌發(fā)的第0、4、6天，與CK處理相比，A1處理可溶性糖含量分別提高了48.27%、53.42%和52.29%，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

在種子萌發(fā)期間，豫花9326種子A1處理的可溶性蛋白含量高于CK處理（圖3b）。在萌發(fā)的第0、4、6天，與CK處理相比，A1處理種子的可溶性蛋白分別提高了59.66%、13.04%和43.76%，差異均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。

圖3 H2O2浸種對(duì)花生種子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effects of H2O2soaking treatments on osmotic regulating substances content of peanut seed

2.6 H2O2浸種對(duì)花生種子內(nèi)源激素含量的影響

如圖4a所示，在萌發(fā)的第0、4、6天，CK處理ABA含量呈增加的趨勢(shì)，A1處理ABA含量表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(shì)。低溫浸種結(jié)束，即萌發(fā)第0天時(shí)，A1處理的ABA含量比CK處理提高了42.75%，顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。在萌發(fā)的第4、6天，與對(duì)照組相比，處理組的ABA含量分別降低了38.61%和16.32%，差異均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。

圖4 H2O2浸種對(duì)花生種子內(nèi)源激素含量的影響Fig.4 Effects of H2O2soaking treatments on endogenous hormones content of peanut seed

如圖4b所示，隨萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，CK和A1處理的GA含量均呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，但CK均低于A1處理。在萌發(fā)的第0、4、6天，相比CK，A1處理GA含量分別提高了176.09%、15.55%和32.02%，差異均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。

如圖4c所示，在種子萌發(fā)過(guò)程中，CK和A1處理下GA/ABA均呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。與CK處理相比，在萌發(fā)的第0、4、6天，A1處理的GA/ABA分別提高了92.44%、60.57%和53.76%，差異均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。

3 討論

低溫脅迫是影響花生發(fā)芽及出苗的關(guān)鍵因素，因此研究花生品種耐低溫發(fā)芽的調(diào)控技術(shù)顯得尤為重要。一些研究[14-15]表明，H2O2能提高低溫脅迫下花生的萌發(fā)能力。本研究選用高油酸品種豫花37和高油品種豫花9326為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)H2O2可以提高2個(gè)花生品種在低溫脅迫下的發(fā)芽水平，然而H2O2緩解豫花9326吸脹冷害的效果比豫花37更顯著，可能是由于豫花37在種子萌芽階段對(duì)H2O2的敏感性較低。

當(dāng)種子在萌發(fā)過(guò)程的吸脹階段受到低溫脅迫時(shí)，首先會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和機(jī)能。低溫使膜的形態(tài)發(fā)生了變化，膜脂發(fā)生凝固，膜從柔軟的液晶態(tài)變?yōu)槟z態(tài)，質(zhì)膜出現(xiàn)裂縫，細(xì)胞透性增大，離子滲漏，破壞了原來(lái)正常的離子平衡[16]。在許多生理生化指標(biāo)中，相對(duì)電導(dǎo)率最能直接反映膜系統(tǒng)的損傷程度[17]，通常相對(duì)電導(dǎo)率越高，表明細(xì)胞膜透性越強(qiáng)，受傷害程度越大，植物抗寒能力越小[18]。在本研究中，當(dāng)?shù)蜏亟N結(jié)束時(shí)，H2O2浸種處理的豫花9326和豫花37電導(dǎo)率分別比對(duì)照降低了47.67%和23.67%。Yu等[19]利用200mmol/L H2O2處理預(yù)冷的綠豆幼苗，相對(duì)電導(dǎo)率從86%降低到21%，與本試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似，但是所選H2O2濃度不同，這可能與所選作物不同或是種子和幼苗對(duì)H2O2敏感度不同有關(guān)。由此可知，H2O2預(yù)處理能降低電導(dǎo)率，減輕低溫對(duì)細(xì)胞膜的破壞。此外，在低溫脅迫下種子會(huì)產(chǎn)生過(guò)剩的自由基，引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用。而膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物MDA會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷生物膜。因此在植物抗寒生理研究中，MDA是鑒定細(xì)胞膜是否被破壞的標(biāo)志物質(zhì)[14,18]。在本研究中，低溫浸種結(jié)束后的萌發(fā)過(guò)程中，無(wú)菌水浸種處理的MDA含量逐漸升高，而H2O2浸種處理的MDA含量逐漸降低。余燕等[15]研究表明，1% H2O2浸種能降低花生種子的MDA含量，從而提高種子的耐寒性，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致，說(shuō)明H2O2浸種預(yù)處理能降低MDA含量和減弱低溫對(duì)細(xì)胞膜脂化程度，但是所選H2O2濃度的不同可能與花生品種或低溫處理方式不同有關(guān)。

低溫脅迫下植物能通過(guò)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)保持細(xì)胞的滲透勢(shì)平衡，維持細(xì)胞原有的正常生理代謝活動(dòng)，其中最主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)[20]。在辣椒[21]、菜豆[22]和油菜[8]等作物的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，低溫能誘導(dǎo)可溶性糖和可溶性蛋白的積累。通過(guò)增加內(nèi)源滲透調(diào)解物質(zhì)的方式，增加細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)含量，提高細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)，提供生物合成所需能量，增加細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合水，降低凝固點(diǎn)，防止細(xì)胞被凍傷，從而增強(qiáng)抗寒性[18,23-24]。在前人[1]有關(guān)花生的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫條件下的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)與可溶性糖和可溶性蛋白含量呈正相關(guān)。與此同時(shí)，H2O2也能影響可溶性糖和可溶性蛋白含量。任艷芳等[25]利用H2O2提高鹽脅迫下小白菜種子內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白的含量，以緩解鹽脅迫對(duì)小白菜萌發(fā)的抑制作用。上述研究與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。在本研究中，低溫浸種結(jié)束和萌發(fā)階段，H2O2浸種處理的種子可溶性糖和可溶性蛋白含量、增長(zhǎng)量均顯著高于對(duì)照。由此可推測(cè)，H2O2處理可通過(guò)調(diào)控花生種子內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白的含量，達(dá)到提高種子萌發(fā)期耐寒性的作用。

種子的萌發(fā)過(guò)程受多種激素的調(diào)控，其中ABA對(duì)萌發(fā)有抑制作用，而與其拮抗的激素GA有打破休眠和促進(jìn)胚根突破種皮的作用[26-29]。研究[30-31]認(rèn)為，種子的休眠與萌發(fā)主要受GA和ABA的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控，種子中GA/ABA的比值升高促使種子由休眠向萌發(fā)階段轉(zhuǎn)變，而GA/ABA比例下降使種子進(jìn)入休眠狀態(tài)。此外ABA和GA還是植物對(duì)不同逆境產(chǎn)生響應(yīng)的激素信號(hào)分子，可以廣泛參與各種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)[32]。在夏軍等[33]的研究中，低溫可誘導(dǎo)海島棉種子內(nèi)源激素GA的合成和GA/ABA升高，抑制ABA合成，進(jìn)而有助于內(nèi)源抑制物質(zhì)的降低，促進(jìn)海島棉對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)能力和促進(jìn)種子萌發(fā)。此外，在前人[34-35]的研究中發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，通過(guò)使用外源物質(zhì)，進(jìn)而可起到誘導(dǎo)種子降低ABA生成量，提高GA含量和GA/ABA的作用，從而達(dá)到提高植株抗寒性的效果。在本研究中，當(dāng)?shù)蜏亟N結(jié)束后，在萌發(fā)的過(guò)程中，ABA的含量呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(shì)，而GA含量和GA/ABA呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，這和前人研究的結(jié)果不太一致，可能與低溫處理方式的不同或者是所選植物不同有關(guān)。由此推測(cè)，在5℃低溫浸種時(shí)，H2O2促進(jìn)花生種子ABA合成，降低GA含量，使種子維持休眠狀態(tài)，減弱生理代謝活動(dòng)，降低能量消耗，增強(qiáng)種子的耐低溫脅迫能力；而在低溫浸種結(jié)束后的常溫萌發(fā)過(guò)程中，H2O2促使GA含量增加與ABA含量減少，從而維持種子正常的生理代謝活動(dòng)，加快種子萌發(fā)。

4 結(jié)論

經(jīng)吸脹冷害后種子發(fā)芽受到抑制，而H2O2浸種能減弱低溫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用。H2O2處理可通過(guò)降低花生種子電導(dǎo)率和MDA含量以維持細(xì)胞膜的完整性，提高可溶性糖和可溶性蛋白的含量維持細(xì)胞滲透平衡，調(diào)控內(nèi)源激素ABA和GA含量，激活種子的抗寒生理過(guò)程，從而提高花生種子萌發(fā)期的抗寒性。