羅漢果皂苷Ⅴ通過PI3K/Akt通路抑制過氧化氫誘導的MIN6細胞氧化損傷

韓夢潔，王 娟，劉國翔，李 婷，周璐煒，陳 旭

(桂林醫學院藥學院，廣西 桂林 541100)

羅漢果廣泛分布于廣西桂林永福縣、臨桂縣[1]，作為一種常用的藥食兩用的植物，羅漢果具有降血糖、抗炎抑菌、抗氧化等作用[2]。羅漢果主要含有由三萜皂苷類、黃酮類、多糖類等物質[3]，其中羅漢果皂苷V(mogroside V，MV)是其主要的活性成分[4]，MV是一種三萜類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、止咳潤肺、降血糖等作用[5]。糖尿病是一種以血糖水平升高為表現的慢性疾病，與內分泌代謝紊亂有關。糖尿病已經成為發生率僅次于心血管疾病和腫瘤的疾病，預計到2040年，會有超過6億人遭受糖尿病的侵害[6]。尋找天然的降糖藥物，加強對糖尿病的防治，減輕其并發癥一直是研究者關注的焦點。胰島β細胞是一種內分泌細胞，能貯存和分泌胰島素從而維持體內血糖的穩態[7]。在氧化應激條件下，活性氧(reactive oxygen species，ROS)會對胰島β細胞造成損傷，引起凋亡，從而導致功能障礙，最終引發高血糖。研究表明MV具有抗氧化活性，對氧化應激環境有拮抗作用，從而降低糖尿病并發癥的發生率[2]。但是，其是否能降低胰島β細胞內ROS水平，從而發揮保護胰島細胞的作用仍不清楚。PI3K/Akt是細胞生長、存活、增殖等的重要信號通路[8]，與藤茶總黃酮抑制肝癌的作用有關[9]，且其參與了ROS的氧化應激。本研究通過采用過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)構建小鼠胰島β細胞株MIN6細胞氧化損傷模型，探討MV對MIN6細胞氧化損傷的保護作用及其機制是否與PI3K/Akt信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 小鼠胰島β細胞株MIN6細胞為桂林醫學院生藥學重點實驗室傳代保存。

1.1.2藥物 含量為95.78%的MV(批號：PS000637)購自成都普思生物科技股份有限公司。

1.1.3主要試劑 DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國CLACK公司；噻唑藍(MTT)購自北京索萊寶公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國BD公司；RIPA強裂解液購自上海Beyotime公司；BCA蛋白定量測定試劑盒購自上海Beyotime；β-actin單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Bcl-2、PCNA、Akt等單克隆抗體購自美國Abcam公司；p-Akt單克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；MK2206購自于美國MedChemExpress公司；鼠二抗及兔二抗均購自上海Abmart公司；Western一抗稀釋液購自上海雅酶生物科技有限公司；硝酸纖維素膜購自美國Pall公司；H2O2購自西隴化工廠；ECL超敏化學發光試劑購自合肥Biosharp公司。

1.1.4儀器 流式細胞儀購自美國BD公司(BD C6 plus)；Galaxy 170S型二氧化碳培養箱購自德國Eppendorf公司；A2-4S1級2型生物安全柜購自新加坡ESCO公司；Infinite M200Pro型酶標儀購自瑞士TECAN公司；蛋白電泳系統購自美國Bio-Rad公司；蛋白轉印系統購自美國Bio-Rad公司；電泳儀電源購自美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機購自美國Thermo公司；TDZ4-WS型臺式低速離心機購自湘儀離心機儀器有限公司；ECL化學發光儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1藥物的配制 (1)MV為白色粉末，用PBS配制成濃度為100 g·L-1的母液，根據實驗所需用DMEM培養基稀釋至所需濃度。(2)將30%H2O2(10 mol·L-1)加PBS配置成60 mmol·L-1的母液，現用現配，根據實驗要求用培養基稀釋成所需濃度。

1.2.2細胞培養 將MIN6細胞復蘇后，5 mL培養基混勻后，放入7 cm培養皿中，搖勻，放置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養至細胞密度為80%～90%時，進行傳代。

1.2.3MTT試驗檢測細胞活力 將處于對數生長期的MIN6細胞，胰酶消化后，加入適當的培養基制成細胞懸液，利用細胞計數儀計量細胞懸液中的細胞密度。調整細胞密度為4×103個/孔接種于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。過夜貼壁后，設置空白對照組(Control，Ctrl)、H2O2組(500 μmol·L-1)、MV組(100 mg·L-1)以及MV保護組(MV預處理1 h后加入H2O2)，空白對照組加入等體積培養基，每組濃度設6個復孔。藥物處理后，置于37 ℃，5% CO2培養箱中分別培養24 h后，每孔加入20 μL MTT。繼續培養4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，用槍吹打使結晶溶解，混勻。在490 nm波長處測吸光度(OD)。

1.2.4流式細胞凋亡檢測 取對數生長期MIN6細胞種于7 cm培養皿中，貼壁后，按照“1.2.3”中分組方式加入相應濃度的藥物。作用24 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集細胞，離心后加入1 mL PBS洗滌細胞后再次離心。棄上清，加入200 μL Binding buffer，5 μL FITC和5 μL PI，室溫避光孵育30 min。加入200 μL Binding buffer，300目篩網過濾后，BD C6 Plus 流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.52′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測ROS 取對數生長期的MIN6細胞，0.25%胰酶消化后，種于6孔板中。貼壁后，加入藥物處理24 h。藥物處理完畢，棄去培養基，用PBS洗滌，用0.25%胰酶消化后加入600 μL培養基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，用PBS洗滌。加入500 μL ROS探針DCFH-DA(2 μmol·L-1)后，37 ℃孵育20 min。孵育結束后，用PBS洗滌3次，加入300 μL PBS懸浮細胞，300目篩網過濾后，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.2.6Bcl-2、PCNA蛋白水平檢測 取對數生長期MIN6細胞種于10 cm培養皿中，貼壁后，加入相應濃度藥物處理。處理結束后，將細胞收集于1.5 mL EP管中，根據細胞沉淀量加入適量的RIPA強裂解液，用1 mL的移液器將細胞沉淀吹散，放置于冰上30 min，使得細胞沉淀得以充分裂解。12 000 r·min-1離心30 min，將上清移至預冷的1.5 mL EP管中。BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。根據蛋白濃度以及所需體積，并加入5×SDS、ddH2O使上樣體積為20 μL。根據蛋白分子量配制相應濃度的分離膠，SDS-PAGE電泳分離120 min，轉膜60 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗膜后分別加入相應的一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次，室溫孵育對應的二抗，再洗膜4次。ECL發光及進行灰度值計算分析。

2 結果

2.1 MV抑制了H2O2誘導的MIN6細胞的損傷作用我們使用25～1 600 mg·L-1的MV處理MIN6細胞，發現100 mg·L-1以內的MV處理MIN6細胞與對照組之間的細胞活力值無差異(P>0.05)，結果表明100 mg·L-1以下的MV對MIN6細胞幾乎無毒性(Fig 1A)。在光學顯微鏡下觀察細胞形態發現，對照組細胞生長狀況良好，細胞膜邊緣清晰可見，H2O2單獨處理的細胞數減少，細胞皺縮變圓、變亮，細胞損傷嚴重。結果提示，H2O2抑制了MIN6細胞增殖并極可能誘導了細胞死亡。MV預處理組與H2O2單獨處理組相比，MV預處理組細胞密度有所增加，細胞碎片減少(Fig 1B和C)，說明MV對H2O2誘導的MIN6細胞損傷具有一定的保護作用。

Fig 1 The protective effect of mogroside Ⅴ

2.2 MV對H2O2誘導MIN6細胞凋亡的影響流式結果表明，H2O2作用于MIN6細胞后，細胞凋亡率達到了21.2%。MV預處理后，能減少H2O2誘導的細胞凋亡至15%，差異具有統計學意義(P<0.05)。因此，MV可以部分抵抗H2O2的氧化應激，從而保護MIN6細胞，減輕其氧化損傷，減少MIN6細胞的凋亡(Fig 2)。

Fig 2 Effect of mogroside Ⅴ on apoptosis of MIN6

2.3 MV對MIN6細胞ROS釋放的影響流式結果顯示，H2O2作用于MIN6細胞后，ROS的釋放增加，因此導致了MIN6細胞的死亡。MV預處理MIN6細胞后，能顯著減少H2O2誘導的ROS(P<0.05)(Fig 3)，這可能與其具有抗氧化的藥理活性有關。MIN6細胞ROS水平下調，細胞氧化損傷降低，細胞凋亡減少。

Fig 3 Effect of mogroside Ⅴ on reactive oxygenspecies (ROS) in MIN6

2.4 MV對MIN6細胞Bcl-2、PCNA、Akt和p-Akt蛋白表達的影響我們進一步通過Western blot分析增殖以及凋亡相關因子Bcl-2、PCNA和Akt的表達。結果顯示，H2O2使MIN6細胞中PCNA、Bcl-2以及p-Akt蛋白的表達降低，這可能是H2O2處理后導致細胞減少，細胞凋亡的原因。MV預處理后，能減輕H2O2對MIN6細胞內PCNA以及Bcl-2表達的抑制及Akt的活性下降，進而提高了MIN6細胞活性及抑制其凋亡(Fig 4)。

Fig 4 Effect of mogroside Ⅴ on protein volume expression of MIN6

2.5 MV減輕Akt抑制劑對MIN6細胞的氧化損傷為進一步驗證Akt在MV對MIN6細胞中的作用，我們使用Akt抑制劑MK2206處理MIN6細胞，發現MK2206能引起MIN6細胞凋亡，而且MV也可以部分逆轉其對MIN6細胞的損傷(Fig 5A)(P<0.05)。同時發現，MK2206也可以使細胞內ROS水平增加(Fig 5B)(P<0.01)，這與H2O2導致MIN6細胞發生氧化損傷的結果一致。此外，蛋白水平分析顯示，MV也可以上調MK2206導致的PCNA以及Bcl-2表達降低以及Akt的活化(Fig 5C)(P<0.05)。

Fig 5 The oxidative damage on MIN6 cells caused by Akt inhibitor alleviated by mogroside

3 討論

糖尿病是全球最主要的代謝性疾病之一[9]。胰島β細胞能夠分泌和貯存胰島素，其增殖的減少以及受損抑制了胰島素的分泌。本研究結果顯示，MV能夠增加H2O2誘導的MIN6細胞的增殖。PCNA與細胞增殖密切相關，其表達水平的高低可反映MIN6細胞的增殖活性。Western blot結果顯示，MV逆轉了H2O2誘導的PCNA表達減少。因此，推測MV通過增加PCNA的表達來促進H2O2誘導的MIN6細胞增殖。

氧化應激是糖尿病的病理基礎之一，其能夠損傷胰島β細胞以及導致胰島素抵抗。胰島β細胞中的抗氧化酶水平較低，對高糖、高脂、炎癥因子等刺激因子非常敏感，導致其容易受到ROS介導的氧化應激損傷[10]。本研究表明，MV能夠減少H2O2誘導的ROS釋放。這提示MV可能通過抑制氧化應激減少MIN6細胞氧化損傷。細胞內產生氧化應激，ROS增加的同時，常常伴隨著細胞凋亡的發生。胰島β細胞的凋亡也是糖尿病發生的一個重要因素。過量ROS的產生會激活線粒體凋亡通路，從而誘導細胞發生凋亡。當凋亡刺激作用于線粒體時，會導致促凋亡和抗凋亡因子表達的失衡，從而誘導細胞凋亡。Bcl-2是重要的抗凋亡因子，細胞凋亡的發生常常伴隨著其表達的減少。我們研究發現，MV能夠上調H2O2誘導的Bcl-2表達減少。因此，我們推測MV減少H2O2誘導的凋亡機制可能與增加Bcl-2的表達有關。

PI3K/Akt信號通路是細胞的重要調節通路，與增殖凋亡密切相關。我們發現MV干預后，能夠保護H2O2誘導的PI3K/Akt失活。有研究表明，磷酸化的Akt蛋白可以使Bcl-2從聚合體中釋放出來，從而發揮抗凋亡作用。為了確定Akt的活化確實參與了MV對MIN6細胞的保護作用，我們使用了Akt的抑制劑MK2206。我們發現Akt抑制劑MK2206可以升高MIN6細胞內的ROS水平以及造成細胞凋亡，而MV也可以減輕其對MIN6細胞的氧化損傷。因此，MV上調氧化損傷MIN6細胞內Bcl-2的表達可能與激活上游Akt信號通路有關。

綜上所述，MV通過促進胰島β細胞的增殖，抑制凋亡的發生以及減少ROS的水平保護了H2O2誘導的MIN6細胞損傷，其機制可能與促進PI3K/Akt的活化增加Bcl-2的表達有關。