鹽酸氟西汀對高原腦水腫大鼠腦組織的保護作用

鄒蓓蕾，潘 菁，吳慶豐，張朋朋，石志群，田貽婷，李文斌，馬慧萍

(聯勤保障部隊第九四〇醫院1.藥劑科、2.衛勤部，甘肅 蘭州 730050；3．中國科學院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

鹽酸氟西汀是一種是經典的5-羥色胺轉運體(serotonin transporter，SERT)抑制劑，屬于選擇性血清素再攝取抑制劑，臨床上廣泛用于治療嚴重抑郁癥[1]。動物研究表明，氟西汀具有神經保護[2]、抗炎[3]、改善空間記憶及認知[4]作用。Hu等[5]發現，在暫時性大腦中動脈閉塞大鼠模型中氟西汀可以調節HIF-1α-Netrin/VEGF級聯蛋白的表達，促進血管生成，改善缺血性卒中后的長期功能恢復。舒曉東等[6]發現，氟西汀通過促進線粒體自噬，減少抑郁癥發生發展中星形膠質細胞的死亡和萎縮，發揮對星形膠質細胞的保護作用。孫慧等[7]發現，鹽酸氟西汀與尼莫地平聯合使用能夠顯著減少腦中梗死面積，改善行為學和認知功能損傷，其機制可能與減少腦中炎癥反應，升高BDNF水平相關。況超等[8]發現，氟西汀可通過減少AD小鼠海馬DG區神經元的數量丟失和下調AD小鼠海馬區Ach E表達量，從而改善AD模型小鼠的空間學習記憶能力。

經過課題組前期蛋白質組學研究篩選，于細胞模型、動物模型mRNA水平、蛋白水平實驗，發現缺氧條件下SERT蛋白高表達，給藥后SERT蛋白表達減少，由此我們猜測SERT蛋白可能為治療高原腦水腫(high altitude cerebral edema,HACE)的一個靶點，而氟西汀作為經典的SERT抑制劑，可能對高原缺氧損傷具有一定的保護作用；研究表明，HACE一般為炎性水腫，而氟西汀具有抗炎作用。曹琪璐等[9]發現，鹽酸氟西汀對缺氧PC12細胞具有保護作用，最佳給藥濃度為10-6mol·L-1，其作用機制可能與緩解氧化應激、抑制細胞凋亡有關。動物實驗方面，我們試圖通過大型低壓低氧模擬艙進行HACE造模，鹽酸氟西汀灌胃給藥，研究鹽酸氟西汀對大鼠HACE模型的保護作用；同時，基于文獻報道的氟西汀具有促進神經血管生成的作用，我們試圖研究缺氧時鹽酸氟西汀給藥對HIF-1α/VEGF/MMP-9這一信號通路的影響，以及與氧化應激和脂質代謝的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器 大型低壓低氧動物艙(FLYDWC50-IIA，貴州風雷)；臺式冷凍離心機(Microfuge22R，BACKMAN COOLTER)；快速研磨儀(FTissuelyser，上海凈信)；電泳槽(Criterion型，美國Bio-Rad)，多功能酶標儀(Spectramax i3，Molecular Devices公司)。

1.1.2實驗動物 SPF級健康♂Wistar大鼠72只，體質量為(220±20)g，購于斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，動物生產合格證號為SCXK(京)2019-0010，動物使用合格證號為SYXK(軍)2017-0047。于聯勤保障部隊第九四〇醫院動物實驗科適應性飼養3 d后進行實驗，實驗方案得到聯勤保障部隊第九四〇醫院倫理委員會的批準。

1.1.3藥品與試劑 鹽酸氟西汀膠囊(禮來蘇州制藥有限公司)，乙酰唑胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，甲酰胺(北京索萊寶科技有限公司)10%水合氯醛(中國人民解放軍第一醫院)；試劑盒丙二醛(A003-4-1，MDA)、超氧化物歧化酶(A001-3-2，SOD)均購自南京建成生物工程研究所。抗體包括AQP4(ab259318)；HIF-1α(ab179483)；VEGF(ab1316)；MMP-9(ab58803)；SERT(ab254358)小鼠抗β-actin(中杉金橋，TA-09)。

1.2 方法

1.2.1常壓密閉缺氧實驗 取BALB/c♂小鼠50只，體質量(20.0±2.0)g，隨機分為5組，每組10只，分別為缺氧模型組(M，滅菌注射用水)、乙酰唑胺組(ACZ，100 mg·kg-1)、鹽酸氟西汀低劑量組(F-L，2.8 mg·kg-1)、鹽酸氟西汀中劑量組(F-M，14 mg·kg-1)、鹽酸氟西汀高劑量組(F-H，28 mg·kg-1)，灌胃給藥14 d，最后一次給藥1 h后，將各組小鼠放入涂有凡士林的250 mL廣口瓶中(瓶中需提前放入用紗布包裹的5 g鈉石灰和濾紙)，擰緊瓶蓋，確保不漏氣，記錄每只小鼠的開始實驗的時間以及死亡時間，計算小鼠存活時間，并根據實驗結果選取最佳給藥劑量。

1.2.2高原腦水腫大鼠模型建立 取♂Wistar大鼠68 只，隨機分為4 組：正常組(NC)、模型組(M)、乙酰唑胺組(ACZ，200 mg·kg-1)、鹽酸氟西汀組(FLX，10 mg·kg-1)，每組17只。將正常組大鼠放置于氧艙外部(即飼養于蘭州當地海拔，高度約為1 500 m)，其余3組大鼠放入大型低壓低氧氧艙內，并按照10 m·s-1的速度將艙內海拔升至6 000 m，設置晝夜溫差并附加寒冷條件，即溫度為12 ℃(8 ∶00-20 ∶00)/2 ℃(20 ∶00-次日 8 ∶00)。大鼠自由進食進水，放在氧艙內3 d，待d 4時進入氧艙，在當地海拔1 500 m(NC組)和海拔3 500 m(其余3組)的高度完成取材。

1.2.3大鼠腦含水量測定 各組取大鼠10只，腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠完全麻醉后處死，迅速解剖并分離腦組織，取左半腦迅速稱組織濕重，然后將其置于濾紙上放入80 ℃恒溫烘箱中烘72 h，稱組織干重，確保達到恒重(前后2次質量誤差小于0.000 3 g)，計算腦含水量/%=(濕重-干重)/濕重×100%

1.2.4大鼠腦通透性測定 每組取大鼠5只，腹腔注射2%EB溶液，24 h后麻醉處死，迅速取出全腦，用生理鹽水洗去腦組織表面的血液，然后用濾紙吸干。稱取100 mg右半腦，將其剪成3個約10 mm的小塊，加入3 mL甲酰胺。60 ℃水浴放置24 h，離心，取上清液，用酶標儀測定上清液OD620 nm值。

EB標準曲線的制備：將伊文思藍溶于甲酰胺中得到EB貯備液，梯度稀釋為不同濃度的EB溶液。溶液濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg·L-1，從每種濃度EB溶液分別取出200 μL，測定OD620 nm，繪制標準曲線。

1.2.5大鼠腦組織病理學觀察 每組各取2個大鼠腦組織，用0.9%生理鹽水清洗表面血液，10%的中性甲醛溶液固定48 h，于腦的視交叉后切片，繼續固定，樣品用石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6腦組織中氧化應激相關指標的測定 選取測定腦組織含水量的10只大鼠，麻醉并解剖，取右腦，生理鹽水沖洗血漬，濾紙吸干水分。稱質量，加入質量9倍的生理鹽水，每管加入兩顆鋼珠，配平，使用勻漿機進行組織勻漿，60 Hz，60 s; 4 ℃離心，3 500 r·min-1，10 min，取上清液測定氧化應激相關指標即MDA含量、T-SOD活力。

1.2.7腦組織中缺氧相關蛋白的表達 選取測定腦組織含水量的10只大鼠，麻醉并解剖，取右腦，稱質量，加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，置于2 mL EP管中，每管加鋼珠2顆，配平，低溫勻漿。室溫靜置30 min，12 000 r·min-1低溫(4 ℃)離心，取上清；BCA 法測定蛋白濃度，計算上樣量。取離心后的上清加入4×上樣緩沖液(1/3樣品體積)，100 ℃，5 min，使蛋白變性，分裝樣品。配制凝膠電泳，上樣，電泳(80 V/20 min ，110 V/40 min)，轉膜(220 mA，1.5 h)，然后將PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉 2 h。VEGF(1 ∶2 000)，AQP4(1 ∶1 000)和 β-actin(1 ∶3 000)，一抗4 ℃孵育，過夜。次日洗膜，1×TBST 緩沖液洗滌4×10 min；二抗孵育2 h，再次洗膜4×10 min，結束后在膜上滴加ECL發光液使其顯色發光，統計蛋白發光程度。使用ImageJ進行量化，灰度值表示。

1.2.8MRI對高原腦水腫的評估 使用oper-1.0 T MRI掃描儀大鼠體線圈，T2壓水圖像(T2-Flair)序列進行掃描。序列參數如下：T2-Flair的參數為：TR/TE=8000/92 ms，THK=1.50，GAP=0.30，FOV=80×80 mm，FA=90.0。

在大型低壓低氧氧艙于海拔3 500 m將大鼠處死，保留缺氧狀態隨后將大鼠固定在核磁線圈上，進行掃描。

2 結果

2.1 常壓密閉缺氧實驗如Tab 1所示，與M組相比，F-M組的存活時間明顯延長，延長率為17.78%，差異有顯著性(P<0.05)；與M組相比，F-L組和F-H組存活時間有所延長，但不存在顯著性差異(P>0.05)。其中，F-M組大鼠的延長率與乙酰唑胺組接近，效果最佳。因此，選取鹽酸氟西汀中劑量為最佳給藥劑量進行后續實驗。

Tab 1 Effects of fluoxetine on survival time of mice under

2.2 大鼠腦含水量測定如Fig 1所示，與NC組相比，M組大鼠腦組織含水量明顯增多，差異有顯著性(P<0.05)；與M組相比，FLX組腦組織含水量明顯下降，差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 1 Water content of brain tissues of rats

2.3 大鼠腦通透性測定如Fig 2所示，與NC組相比，M組大鼠腦組織中EB含量明顯增加，差異有顯著性(P<0.01);與M組相比，FLX組大鼠腦組織內EB含量明顯減少，差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 EB content in rat brain tissues

2.4 大鼠腦組織病理學觀察如Fig 3所示，與NC組相比，M組大鼠大腦皮層神經細胞損傷嚴重，核固縮明顯，血管腫脹，血管周圍間隙明顯擴大；細胞空泡化增多；M組大鼠海馬區細胞排列紊亂，細胞核固縮，細胞數量減少。給予藥物干預后，大腦皮層細胞核固縮及血管腫脹現象有所改善，海馬區細胞排列較為整齊，并且鹽酸氟西汀的治療效果優于乙酰唑胺。

Fig 3 Pathological observation of brain tissue staining in cerebral cortex and hippocampus of rats (HE×400)

2.5 腦組織中氧化應激相關指標的測定如Fig 4所示，與NC組相比，M組大鼠腦組織中 MDA含量明顯上升(P<0.01)，T-SOD活力明顯降低(P<0.01)；與M組相比，ACZ 組腦組織中MDA含量明顯降低(P<0.01)，但T-SOD的活力無明顯影響；FLX組大鼠腦組織中MDA含量明顯降低(P<0.01)，T-SOD活力明顯升高(P<0.01)。

Fig 4 MDA content and SOD activity in rat brain tissues

2.6 腦組織中缺氧相關蛋白的表達如Fig 5所示，與NC組相比，M組大鼠腦組織中HIF-1α、VEGF、MMP-9、AQP4蛋白表達明顯增加(P<0.01)，SERT蛋白表達明顯增加(P<0.05);與M組相比，ACZ 組腦組織中HIF-1α蛋白表達明顯增加(P<0.01)，VEGF、MMP-9、AQP4、SERT蛋白表達明顯增加(P<0.05)；FLX組大鼠腦組織中MMP-9、AQP4蛋白表達明顯增加(P<0.01)，HIF-1α、VEGF、SERT蛋白表達明顯增加(P<0.05)。

Fig 5 Expression of hypoxia-related proteinin brain tissues of rats

2.7 MRI對高原腦水腫的評估HACE在MRI上的特征在于白質水腫且好發于胼胝體壓部。如Fig 6所示，與NC組相比，M組大鼠腦部胼胝體處呈現明顯高信號；與M組相比，ACZ組和FLX組信號有所降低；ACZ組信號降低但是高于正常組，FLX組信號降低且與正常組接近。

Fig 6 MRI evaluation of cerebral edema in rats during hypoxia and drug intervention

3 討論

當機體從平原快速進入高原后，會因為缺氧、低壓、寒冷等環境因素產生一系列高原反應，如頭痛、失眠、耳鳴、眩暈等，進而導致一系列急性高原病，比如高原肺水腫和HACE。HACE是急性高山病或高原肺水腫的繼發病，目前HACE 急救用藥主要為地塞米松，乙酰唑胺與地塞米松聯合使用[10-11]。目前，HACE治療藥物主要有以下幾種機制：維持腦細胞膜完整性，促進神經功能的恢復；改善腦細胞代謝和腦循環;減輕腦血管滲漏，促進腦血管生成；抑制氧化應激和炎癥反應，抑制炎性因子的表達[12]。目前HACE沒有特異性用藥，開發HACE防治新藥迫在眉睫。

本實驗小鼠常壓密閉實驗所選擇的鹽酸氟西汀3個劑量均根據文獻調研和人與大鼠的種屬間劑量換算所得，并篩選確定鹽酸氟西汀抗缺氧的最佳劑量，為鹽酸氟西汀中劑量14 mg·kg-1，該劑量下小鼠的存活時間及延長率最高；同時，大鼠高原腦水腫模型的建模條件成熟，重復性、穩定性較好[13]。以上實驗證明，鹽酸氟西汀可改善HACE所造成的缺氧損傷，具有一定程度的保護作用。

同時，氧化應激與能量代謝相關結果表明，與正常組大鼠相比，缺氧模型組大鼠MDA含量增加，SOD酶活性降低，給予鹽酸氟西汀后，MDA和SOD結果均得到改善。這一現象可能的解釋是，缺氧條件下可能會刺激機體產生氧化應激，生物體內氧分子分解產生大量氧自由基，過量自由基會引發脂質過氧化反應，產生大量MDA，導致抗氧化酶 SOD活性降低，這些都表明缺氧后機體抗氧化能力下降[14]，而給予鹽酸氟西汀干預后會清除一部分自由基，從而使機體內自由基含量重新平衡。

為了進一步探討鹽酸氟西汀對腦血管生成以及對SERT蛋白表達的影響[15]，我們提取腦組織蛋白進行Western blot實驗。結果表明，缺氧模型組HIF-1α、VEGF、MMP-9、AQP4、SERT蛋白均明顯上調，給予鹽酸氟西汀干預后均明顯下調。HIF-1α為缺氧感知蛋白，AQP4為水通道蛋白，是HACE發生的標志蛋白[15]，缺氧條件下這兩種蛋白上調表明HACE模型比較成功；SERT蛋白的變化證明了我們的猜想，即SERT蛋白可能為HACE的一個靶點；有文獻表明，氟西汀可以防止鼠百合堿誘導的肺動脈高壓，是通過 ERK1/2磷酸化途徑減少ROS生成和降低HIF-1α和VEGF蛋白水平實現的，并且腦組織與肺組織中SERT的cDNA同源性達到100%[16]，這也是鹽酸氟西汀具有抗HACE作用的一個佐證。HIF-1α、VEGF、MMP-9這3個蛋白的變化證明了鹽酸氟西汀對腦血管生成的影響可能是通過HIF-1α/VEGF/MMP-9信號通路發揮作用的[17]，這只是初步猜測，還需要RT-PCR和CO-IP實驗進一步驗證。

HACE是一種比較嚴重的急性高原病，臨床表現為意識障礙和軀干共濟失調，影像學顯示血管源性水腫，白質和胼胝體有微出血[18]。核磁共振結果顯示，在6 000 m附加寒冷條件下，T2-flair序列下，模型組大鼠胼胝體處呈現明顯高信號;給予藥物干預后，胼胝體處信號均有所降低，鹽酸氟西汀組效果更好。由于條件有限，我們嘗試DWI、SWI等序列，效果均不太理想，因此我們只簡單地進行形態學觀察判斷大鼠腦部水腫程度。眾多文獻表明，腦水腫發生于肺水腫后，且更加嚴重，腦部微出血也可以觀察到。

綜上所述，鹽酸氟西汀具有HACE防護作用，其機制可能為減輕腦血管滲漏，促進腦血管生成；抑制氧化應激和炎癥反應，抑制炎性因子的表達。鹽酸氟西汀作為經典的抗抑郁藥，近年來被學者開拓了很多新的研究方向，如肺動脈高壓、腸易激綜合征、結腸癌、帕金森綜合征等，這都體現了開發氟西汀的重大價值和意義。