聯(lián)合Septin9基因甲基化、FOBT及CEA檢測在結(jié)腸癌患者診斷中的臨床意義

姚冠羽 陳海平 張維東 潘萬能 張清華 沈明海 陸可 董其峰

結(jié)腸癌在消化道惡性腫瘤中常見，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界，40～50歲多見。早期診斷困難導(dǎo)致其發(fā)病率及死亡率居高不下，多數(shù)患者就診時(shí)已為中晚期。因此，結(jié)腸癌的早期診斷和篩查尤為重要。然而，糞便隱血試驗(yàn)（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）診斷效能低下，加之患者對(duì)腸鏡檢查依從性差，均導(dǎo)致臨床診斷效能差。因此，提高結(jié)腸癌診斷效能很重要。近期研究發(fā)現(xiàn)特定基因的異常甲基化對(duì)結(jié)腸癌的早期診斷具有重大診斷意義。其中，甲基化Septin9基因是消化道腫瘤早期診斷的重要生物標(biāo)志物［1-2］。本研究擬對(duì)結(jié)腸癌患者、癌前病變及健康人群的外周血Septin9基因甲基化、FOBT和CEA同時(shí)進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)單獨(dú)檢測Septin9基因甲基化、FOBT和CEA及聯(lián)合檢測在結(jié)腸癌診斷中的臨床意義及應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 結(jié)腸癌患者的診斷依據(jù)中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)結(jié)直腸癌診療指南（2020年版）［3］。收集2016年1月至2020年9月杭州西溪醫(yī)院普通外科胃腸專業(yè)組收治的56例結(jié)腸癌患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料進(jìn)行分析。56例經(jīng)腸鏡檢查取病理活檢證實(shí)結(jié)腸腺瘤的為癌前病變組，21例經(jīng)腸鏡結(jié)果無明顯異常的為健康對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 結(jié)腸癌Septin9基因甲基化基因檢測試劑盒PCR-熒光探針法，江蘇為真生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司盒（批號(hào)20183400103）、ABI 7,500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（CEA）檢測使用美國羅氏Cobas 801全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（試劑批號(hào)為377028）。

1.3 檢測方法 采靜脈血用EDTA-K2抗凝采血管，采血量為5 mL，將采取血液標(biāo)本用3,000 rpm離心10 min，分離出血漿，提取血漿游離DNA需按試劑盒說明進(jìn)行。并在ABI 7,500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測，同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。測得Septin9基因甲基化結(jié)果分陽性及陰性，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分別大于及小于臨界值。腫瘤標(biāo)記物CEA的檢測采用美國羅氏Cobas 801全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，全自動(dòng)檢測并設(shè)置質(zhì)控，參考區(qū)間為0～5 ng/mL，＞5 ng/mL判斷為陽性，＜5 ng/mL判斷為陰性。FOBT采用全自動(dòng)糞便分析儀（珠海科域生物工程股份有限公司）進(jìn)行全自動(dòng)檢測（KU-F20）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GRAPHPAD5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，診斷效能通過ROC曲線分析檢測。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 三組的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組一般資料比較（±s）

表1 三組一般資料比較（±s）

2.2 三組Septin9基因甲基化、FOBT及CEA檢測結(jié)果比較 結(jié)腸癌患者Septin9基因甲基化陽性46例，陰性10例；FOBT陽性47例，陰性9例；CEA陽性49例，陰性7例。癌前病變組Septin9基因甲基化陽性18例，陰性38例；FOBT陽性37例，陰性19例；CEA陽性18例，陰性38例；健康對(duì)照組Septin9基因甲基化陽性2例，陰性19例；FOBT陽性1例，陰性20例；CEA陽性1例，陰性20例。見表2。

表2 三組Septin9基因甲基化、FOBT及CEA檢測結(jié)果比較

2.3 聯(lián)合Septin9基因甲基化、FOBT及CEA在結(jié)腸癌患者聯(lián)合檢測診斷效能最高 分別獨(dú)立分析結(jié)腸癌、癌前病變患者及健康對(duì)照者組Septin9基因甲基化、FOBT及CEA的ROC曲線，見圖1。結(jié)果顯示Septin9基因甲基化、FOBT及CEA的AUC分別為：Septin9甲基化 0.8129（95%CI：0.6807～0.9451），F(xiàn)OBT 0.7381（95%CI：0.5893～0.8869），CEA 0.7744（95%CI：0.6338～0.9149）。聯(lián)合FOBT、CEA以及SEPT9甲基化的AUC為0.9127（95%CI：0.8317～0.9937），見表3。結(jié)果顯示聯(lián)合Septin9基因甲基化、FOBT及CEA在結(jié)腸癌患者聯(lián)合檢測診斷效能最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 Septin9基因甲基化、FOBT及CEA在結(jié)腸癌患者及其對(duì)照組診斷效能及聯(lián)合效能ROC曲線分析

表3 Septin9基因甲基化、FOBT及CEA各項(xiàng)指標(biāo)及聯(lián)合檢測在結(jié)腸癌患者及其對(duì)照組中的診斷效能比較

3 討論

結(jié)腸癌已成為全球新增癌癥病例的第3大主要原因。近年來，我國無論是結(jié)腸癌的發(fā)病率還是死亡率都還在持續(xù)上升。結(jié)腸癌早期癥狀隱匿，60%～70%的患者在診斷為結(jié)腸癌時(shí)已為中晚期。結(jié)腸癌早期術(shù)后患者5年存活率可達(dá)到90%，晚期預(yù)后差，死亡率高［4］。定期篩查已被證明是降低發(fā)病率和死亡率的有效方法。美國預(yù)防服務(wù)工作組（US Preventive Services Task Force）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，如果健康人群每年進(jìn)行定期篩查，可避免約60%的結(jié)腸癌導(dǎo)致的死亡，5年平均生存率可從46%提高至73%。因此，加強(qiáng)切實(shí)有效的結(jié)腸癌早期篩查，提高早期腫瘤檢出率，及時(shí)干預(yù)治療，對(duì)降低結(jié)腸癌死亡率和遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率意義重大［5］。目前臨床上結(jié)直腸癌的診斷主要是依靠腸鏡檢查，但是其廣泛普及用于篩查受限，而腫瘤標(biāo)志物的檢測因其簡單、方便、無痛等特點(diǎn)，在結(jié)直腸癌的早期篩查診斷中越來越重要［6］；其中，F(xiàn)OBT和CEA成為篩查人群中結(jié)腸癌的主要方法，但其單一的敏感度和特異度不高，需與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合才能進(jìn)一步提高其敏感性和特異性［7-8］。其中，F(xiàn)OBT因其操作簡便、成本低廉在過去結(jié)腸癌篩查中應(yīng)用最廣泛，但其原理是與血液標(biāo)本中的血紅素相結(jié)合，正因?yàn)榇嗽?，所以其?zhǔn)確性容易受食品及藥物等因素的影響，導(dǎo)致假陽性率偏高，特異性較低等問題［8］。另外，CEA作為目前在結(jié)腸癌和結(jié)腸癌的診斷中最常用標(biāo)志物，其敏感度和特異度分別為38.3%和90.0%［9］。

研究表明DNA甲基化是很多種類癌癥發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)早期事件，特異基因的甲基化可作為腫瘤早期篩查的分子標(biāo)記物［10］。Septin9基因位于染色體17q25.3，廣泛存在于人體細(xì)胞中。研究表明，Septin9有18個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本（基于多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)），編碼15個(gè)多肽。它與乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、頭頸部癌、白血病、淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Septin9基因甲基化檢測與常規(guī)結(jié)腸鏡檢查對(duì)比，其無需檢查前準(zhǔn)備，并且留取標(biāo)本方便，對(duì)于患者不會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)傷及痛苦。因此，廣泛應(yīng)用通過外周血檢測Septin 9基因甲基化對(duì)于進(jìn)一步提高結(jié)直腸癌診斷的效能意義重大，通過早期檢測可直接降低結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率［11-12］。多項(xiàng)研究顯示Septin9 基因甲基化檢測結(jié)直腸癌的敏感度及特異度較高，分別為67%～95.6%及86%～99%，其可用于結(jié)直腸癌早期診斷的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)［13］。但研究顯示其單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對(duì)結(jié)腸癌的檢出率尚有不足，診斷效能較差［14-15］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過回顧性分析本院收治結(jié)腸癌、癌前病變患者和健康對(duì)照組，并采用熒光PCR法檢測外周血血漿Septin9基因甲基化，并統(tǒng)計(jì)FOBT及CEA陽性率。通過ROC分析檢測方法對(duì)結(jié)腸癌患者的診斷效能。發(fā)現(xiàn)Septin9基因甲基化、FOBT及CEA的AUC為0.8129，0.7381，0.7744，而聯(lián)合FOBT、CEA以及Septin9甲基化的AUC高達(dá)0.9127。

進(jìn)一步聯(lián)合檢測外周血血漿游離Septin9基因啟動(dòng)子甲基化、FOBT及CEA顯著提高了結(jié)腸癌患者診斷的診斷效能，且具有準(zhǔn)確、方便、無創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)。因此在可考慮采用此聯(lián)合方法對(duì)結(jié)腸癌高危人群進(jìn)行篩查和診斷，進(jìn)一步提高結(jié)腸癌患者的檢出敏感度和特異度。Septin9與其他檢測方法的聯(lián)合應(yīng)用為結(jié)腸癌篩查提供了一種新的方法。這種方法在檢測和篩查其他癌癥方面的應(yīng)用也是如此。隨著體外診斷相關(guān)方法和自動(dòng)化設(shè)備的快速發(fā)展，筆者相信，Septin9在癌癥檢測和篩查中的前景是光明的。

綜上所述，Septin9檢測方法在結(jié)腸癌篩查和早期診斷中具有足夠的敏感度和特異度，在治療效果、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后方面具有很大的潛力。聯(lián)合檢測包括Septin9甲基化在內(nèi)的多種生物標(biāo)志物可能是未來提高結(jié)腸癌篩查性能和依從性的選擇，并提高早期診斷率。Septin9檢測在篩查設(shè)置中對(duì)無癥狀人群的敏感度仍不令人滿意，且價(jià)格仍遠(yuǎn)高于FOBT、CEA。在其成為預(yù)后標(biāo)志物和治療標(biāo)志物之前，還需要進(jìn)行更多的研究。希望各結(jié)腸診治中心聯(lián)合建立專病聯(lián)盟隨訪中心，通過對(duì)于結(jié)腸癌診治的多中心研究，推動(dòng)我國結(jié)腸癌專病診療水平的進(jìn)步。