HPLC 法測定芴甲氧羰基-L- 亮氨酸（Fmoc-L-Leu-OH）中對映異構體含量

文/許 培 史文青 葛傳軍 劉 虎 卞從明[安徽安科生物工程（集團）股份有限公司]

多肽是指由3～50 個α- 氨基酸縮合后以酰胺鍵連接的一類化合物。分子量介于化藥與蛋白藥物之間，兼顧了化藥純度高、穩定性好及低免疫原性的特點，也具有蛋白藥物特異性強、生物活性高等特點，在腫瘤、糖尿病、心血管疾病、感染等領域有顯著療效[1]。

多肽的制備方式包括生物組織提取、基因重組表達和化學合成法，其中化學合成法有液相合成和固相合成兩種。目前，全球上市的多肽藥物中90%以上是由化學合成制備，且固相合成法應用最為普遍。固相合成法是采用α- 氨基被保護的Boc- 氨基酸或Fmoc- 氨基酸作為起始物料，將其C 端固定在樹脂上，通過一系列“縮合”和“脫保護”操作，直至合成目標序列后再將樹脂與肽鏈裂解，獲得目標肽粗品。由于Fomc- 氨基酸可在堿性條件下進行脫保護，避免中間體反復經強酸處理，可有效降低反應副產物，是目前固相合成法中的最為常用的起始物料[2]。

QbD（質量源于設計）重要理念之一是強調對關鍵原料的關鍵質量屬性進行評估和控制。目前各國藥監部門或國際組織均對API 起始物料質量控制提出要求[3]，如ICHQ11[4]中強調了起始物料的監控及其雜質譜研究的必要性，要求研究者充分了解并評估其在生產過程中的行為，建立其與API 雜質的關系；EMA 于2014 年發布的《化學原料藥生產起始物料的選擇和論證要求的思考》[5]明確了起始物料的評估意見和要求，于2016 年發布的《活性物質化學部分指南》[6]強調“應討論起始物料中的所有種類雜質，如異構體雜質，在后續合成過程中保持不變或作為衍生物留存的可能性。適當時，此類雜質應當在起始物料中通過驗證的檢驗方法控制在合適的限度”；FDA 也發布了多項指導原則[7-8]，明確了起始物料的選擇及控制要求。

芴甲氧羰基氨基酸（Fmoc-aminos）是固相合成多肽的關鍵起始物料，其雜質與最終API 雜質具有顯著的相關性，其中以對映異構體雜質影響最為顯著。該雜質參與縮合反應，會產生與目標物結構、性質極為接近的差向肽雜質[9]。差向肽雜質與API 通常難以分離，給后續提純工藝及產品質量控制帶來挑戰，臨床應用時也可能存在安全及有效性的風險。因此，需建立嚴格的質控要求。

本文以固相合成多肽中較為常用的Fmoc-L-Leu-OH 為研究對象，建立了HPLC 檢測Fmoc-L-Leu-OH 對映異構體Fmoc-D-Leu-OH 含量的方法，并開展了系統的方法學驗證。

一、材料

1.主要材料和試劑

芴甲氧羰基-L- 亮氨酸（Fmoc-L-Leu-OH），芴甲氧羰基-D- 亮氨酸（Fmoc-D-Leu-OH），注射用水，正己烷，無水乙醇，異丙醇，三氟乙酸。

2.主要儀器設備

賽默飛U3000 高效液相色譜系統，紫外檢測器，電子天平。

二、方法與結果

1.試液配制

空白溶液：正己烷∶無水乙醇（55∶45）。

系統適用性溶液：取Fmoc-L-Leu-OH 對照品與Fmoc-D-Leu-OH 對照品適量，用空白溶液配制成Fmoc- L- Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH 濃度分別為2.0 mg/mL、10.0 μg/mL 的混合溶液。

Fmoc-Leu-OH 供試品溶液：取Fmoc-L-Leu-OH供試品，用空白溶液制成濃度為2.0 mg/mL 的溶液。

Fmoc-L-Leu-OH 對照品溶液：取Fmoc-L-Leu-OH對照品，用空白溶液制成濃度為2.0 mg/mL的溶液。

Fmoc-D-Leu-OH 對照品溶液：取Fmoc-D-Leu-OH 對照品，用空白溶液制成濃度為2.0 mg/mL 的溶液。

2.色譜條件

3.專屬性考察

分別取空白溶液、系統適用性溶液按前述色譜條件進樣，考察方法專屬性。空白溶液在Fmoc-D-Leu-OH 色譜峰保留時間9.900 min 左右無吸收峰；系統適用性溶液中Fmoc-L-Leu-OH 色譜峰保留時間為9.900 min，其對映異構體Fmoc-D-Leu-OH 色譜峰保留時間為14.297 min，二者之間分離度為6.38，分離度遠大于2.0，表明方法專屬性良好。

4.檢測限及定量限

取Fmoc-D-Leu-OH 對照品溶液，用空白溶液逐級稀釋至適宜濃度，按前述色譜條件分別進樣測定，分別以信噪比為3∶1、10∶1 時注入儀器的量作為檢測限和定量限。Fmoc-D-Leu-OH 的檢測限、定量限分別為0.300 ng 和1.001 ng，即分別相當于主成分的0.0015%、0.0050%，表明方法色譜靈敏度高。

5.線性范圍考察

取Fmoc-D-Leu-OH 對照品溶液，用空白溶液稀釋成系列濃度分別為0.1 μg/mL（定量限）、0.2μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0μg/mL 的溶液，按前述色譜條件分別進樣測定，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行回歸，確定線性范圍。回歸方程為Y=0.5126X-0.0049，R2=1.0000，表明Fmoc-D-Leu-OH 在質量濃度0.1 ～10.0 μg/mL 范圍內，線性關系良好。

6.準確度（加樣回收）

取Fmoc-L-Leu-OH 供試品、Fmoc-D-Leu-OH 對照品，用空白溶液配制成Fmoc-L-Leu-OH 濃度為2.0 mg/mL、Fmoc-D-Leu-OH 質量濃度分別約為16μg/mL、20 μg/mL、24 μg/mL 溶液各3 份（對映異構體含量相當于質控限度的80%、100%、120%）；另取Fmoc-LLeu-OH 供試品溶液，按照前述色譜條件分別進樣測定，考察高、中、低3 個水平的加樣回收率。3 個不同水平的Fmoc-D-Leu-OH 的平均回收率（n=3）分別為100.85%、100.76%和100.89%；3 個水平總平均回收率（n=9）為100.83%，相對標準偏差（n=9）為0.90%，表明方法準確度高。

7.精密度（重復性）

取Fmoc-L-Leu-OH 供試品、Fmoc-D-Leu-OH 對照品，用空白溶液配制成Fmoc-L-Leu-OH 濃度為2.0 mg/mL、Fmoc-D-Leu-OH 濃度為20 μg/mL 溶液，按照前述色譜條件連續進樣6 次，計算Fmoc-D-Leu-OH色譜峰保留時間和面積的相對標準偏差（n=6），結果分別為0.18%（n=6）和1.86%，說明精密度良好。

8.供試品溶液穩定性

取Fmoc-L-Leu-OH 供試品適量，精密稱定，用空白溶液溶解并稀釋制成每1 mL 中約含2.0 mg 的供試品溶液，于室溫下分別放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h，按照前述色譜條件分別進樣，考察其穩定性。結果顯示，供試品中對映異構體Fmoc-D-Leu-OH 含量未發生變化，空白溶劑對測定無干擾，表明供試品溶液于室溫存放12 h 內穩定。

9.耐用性實驗

改變流速。將色譜條件中的流速分別設定為0.9 mL/min、1.0 mL/min 和1.1 mL/min，其余色譜條件不變，分別進樣，考察不同流速對測定供試品中對映異構體含量的影響。結果顯示，同一供試品在3 種不同流速下Fmoc-D-Leu-OH 檢出結果一致。

改變柱溫。將色譜條件中的溫度分別設定為28℃、30 ℃和32 ℃，其余色譜條件不變，分別進樣，考察不同溫度對測定供試品中對映異構體含量的影響。結果顯示，同一供試品在3 種不同溫度下Fmoc-D-Leu-OH 檢出結果一致。

10. 供試品Fmoc-L-Leu-OH 中Fmoc-D-Leu-OH 含量測定結果

按照建立的方法對3 批Fmoc-L-Leu-OH 進行測定，均未檢出Fmoc-D-Leu-OH，表明供試品中對映異構體雜質含量均低于檢測限（0.0015%），遠低于質控限度（0.1%）。

三、結論

本文按自建的HPLC 方法，通過全面的方法學驗證，建立了Fmoc-L-Leu-OH 中對映異構體含量測定方法。驗證結果表明：空白溶液對測定無干擾，各組分可完全分離；對映異構體檢測限及定量限分別為主成分的0.0015%、0.0050%，本方法靈敏度良好；對映異構體雜質含量在0.1～10.00 μg/mL（相當于雜質含量為0.005%～0.5%）范圍內線性關系良好（R2=1.0000）；低、中、高3 個對映異構體不同濃度的加樣回收率分別為100.85%、100.76%及100.89%；該色譜條件下樣品存放、柱溫、流速耐受性良好。該方法可用于Fmoc-LLeu-OH 中對映異構體含量的測定和控制。