富血小板血漿和弗林蛋白酶激動劑對大鼠膝骨關節炎的緩解作用實驗研究

周安遠，梁朝鑫，楊斯淇，呂 沛，楊 帆，楊 彪，吳立蔚，王哲緯，，楊 淵，5

(1.廣西醫科大學，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學再生醫學與醫用生物資源開發應用協同創新中心，廣西 南寧 530021；3.廣西再生醫學重點實驗室，廣西 南寧 530021；4.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，廣西 南寧 537003；5.廣西醫大開元埌東醫院，廣西 南寧 530028)

膝骨關節炎(Knee osteoarthritis，KOA)是臨床上很常見的一種慢性、退行性、頑固性關節疾病，主要是以關節軟骨退行性病變、膝關節周圍繼發性骨質增生和關節滑膜炎癥等為臨床病理特征[1]。KOA多發于50～60歲人群，是導致其活動困難甚至身體殘疾的重要原因。研究[2-3]顯示，我國大約1.053億人患有KOA，有癥狀KOA患病率約8.1%，并且隨著年齡增長而升高，而單側膝關節置換術總治療費約3.6萬，給患者家庭和社會帶來了極大的經濟負擔。臨床上治療早期KOA常采用口服非甾體抗炎藥、膝關節腔注射透明質酸或皮質類固醇藥物、功能鍛煉、中藥熱敷、物理療法等治療方案。以上方案均有一定的治療效果，但是對軟骨損傷的修復效果作用不大，并且長期療效不佳[4]。雖然可以采取多種治療方案，但是臨床中控制KOA疼痛的效果依然不是很理想，口服長效藥物也會有很大的胃腸道不良反應、心血管意外等風險[5]。采用手術方案時，膝關節修復面積有限，很難解決軟骨進行性損傷和退變的根本問題，最終只能選擇全關節置換手術[6]。富血小板血漿(Platelet rich plasma，PRP)來自人體外周血，富含大量細胞因子，如轉化生長因子-β(TGF-β)、胰島素樣生長因子1(IGF1)、人類生長激素(hGH)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)以及骨形成蛋白(BMP)等，可促進軟骨細胞增殖、成軟骨分化以及軟骨基質合成[7]。大量臨床研究[8-9]表明，PRP可有效緩解早期KOA癥狀，控制疾病進展，改善預后，臨床使用PRP治療KOA已獲得國內專家共識。雖然PRP已經在臨床上廣泛使用，但PRP治療KOA的分子機制尚不清楚。有研究[10]表明，弗林蛋白酶(Furin)是一種鈣依賴性的絲氨酸內切蛋白酶，屬于前蛋白轉化酶家族，其廣泛存在于脊椎動物的細胞中，并通過其酶切作用使無活性蛋白質前體轉化為有活性蛋白形式。所以，我們想到用Furin激動劑激活Furin，進而對膝關節軟骨細胞起到一個正向作用。因此，本研究通過體內外實驗探究PRP和Furin激動劑對SD大鼠KOA的緩解作用，為臨床治療KOA提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 30只8.5周齡雄性SD大鼠和6只2～3 d雄性SD大鼠均購自廣西醫科大學動物實驗中心(許可證號：SYXK桂2020-0004，倫理編號：202105003)。Furin激動劑(批號：AD07025689)購自廣西卓一科技有限公司；DMEM培養基(批號：SH30022.01B)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(批號：21030704)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；0.25%胰蛋白酶(批號：20210717)購自北京索萊寶科技有限公司；Ⅱ型膠原酶(批號：C8150)購自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖(LPS，批號：L2630)購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，批號：SV30087.02)購自美國Hyclone公司；DEPC處理水(批號：C3088)購自德國RUIBIO公司；氯仿(批號：H44020154)購自中國上海國藥公司；異丙醇(批號：80109218)購自中國上海滬試公司；無水乙醇(批號：CNNO.32061)購自中國常熟市鴻盛精細化工有限公司；SYBR Green PCR試劑盒(批號：Thermo F-415XL)和反轉錄試劑盒(批號：Thermo K1622)購自美國賽默飛公司。

1.2 體內實驗

1.2.1 大鼠KOA模型制備與分組：30只SD雄性大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射，麻醉滿意后將大鼠置于仰臥位并固定于手術臺上，常規消毒鋪巾。使用備皮刀對大鼠左、右后肢備皮，用紗布蘸取新潔爾滅清洗后肢，用碘伏消毒后肢。實驗組(10只)和對照組(模型組，10只)大鼠于左右膝平行膝直韌帶內側做2 cm切口，將皮膚、肌肉和筋膜等依次分離，切開關節囊，屈膝90°將髕骨移位，打開關節腔，找到前交叉韌帶并用剪刀離斷，進行前抽屜試驗以保證前交叉韌帶完全離斷，0.9%氯化鈉溶液沖洗關節腔，縫合關節囊和皮膚。假手術組(10只)只切開關節囊，不做任何處理，最后縫合。待所有大鼠蘇醒后放回籠中。

1.2.2 PRP提取與大鼠KOA模型干預：用抗凝管收集各組大鼠外周全血，首先以215 g速度離心10 min。離心結束可見血液分為3層，上層淡黃色清液為血漿層，中間呈白色主要為白細胞、高濃度血小板層，下層深紅色部分主要為紅細胞層。用注射器插入抗凝管底部吸取紅細胞層棄除，然后以863 g速度離心12 min，可見分為血漿層和高濃度血小板白細胞層。棄除上清至初始全血的10%，則為所需PRP。按照PRP∶氯化鈣為1∶9的比例加入氯化鈣溶液，放進4 ℃冰箱過夜激活，次日可見PRP形成凝膠狀，再以1500 r/min離心5 min，見凝膠狀物沉淀于底部，上層清液即為被激活后的PRP。將被激活的PRP進行過濾，除去細菌及白細胞后分裝至EP管中凍存至-80 ℃冰箱中保存備用。實驗組關節腔隔天注射激活后的PRP 0.5 ml，對照組和假手術組關節腔隔天注射0.9%氯化鈉溶液0.5 ml，持續4周。

1.2.3 膝關節病理脫鈣染色：各組大鼠關節軟骨組織脫蠟后常規石蠟包埋切片，做HE染色、番紅固綠染色、甲苯胺藍染色后顯微鏡拍照取圖分析。①石蠟切片：固定新鮮組織24 h以上，取出后置于通風櫥內，用眼科剪將目的部位組織修平整后放入脫水盒中。將脫水浸蠟后的組織放入包埋機，包埋完畢后用切片機切片(厚4 μm)，烤干后取出常溫保存備用。②HE染色：蘇木素染色細胞核3～8 min，PBS水洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。伊紅染色細胞質1～3 min。最后將切片依次放入無水乙醇和二甲苯5 min脫水透明，切片晾干后用中性樹膠封片。③番紅固綠染色：切片放入番紅染液中染色1～2 h，流水沖洗去除多余染料。將切片依次放入50%、70%、80%梯度酒精中各3～8 s脫色，再放入固綠染液中染色30～60 s。無水乙醇三缸脫水后，將切片放入干凈二甲苯透明5 min，用中性樹膠封片。④甲苯胺藍染色：把切片浸入甲苯胺藍染液靜置5 min，用流水沖洗后以1%冰醋酸稍分化。流水沖洗終止反應后，在顯微鏡下精確控制其分化程度。再次沖洗，把切片放于烤箱中烘干，用透明中性樹膠封片。

1.2.4 膝關節免疫組化染色：石蠟切片脫蠟至水后抗原修復，放入3%過氧化氫溶液，室溫下避光孵育25 min。將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上洗滌3～5次，每次5 min，用血清封閉30 min。去掉封閉液，將配好的一抗滴到切片上，然后放入濕盒以4 ℃孵育12 h。將與一抗相應種屬的二抗覆蓋，室溫下孵育50 min。將玻片置于PBS中洗滌3次，每次5 min。滴入DAB顯色液，用顯微鏡調控好顯色時間，如果顯色為棕黃色即為陽性，流水沖洗切片終止顯色。細胞核最后用蘇木素染色，脫水封片。檢測軟骨蛋白聚糖抗體(ADAMTS)-5和白細胞介素-1β(IL-1β)兩種相關抗體的表達。

1.3 體外實驗

1.3.1 大鼠原代細胞提取與培養：采用過量麻醉藥將2～3 d雄性SD大鼠處死，在無菌條件下把其膝關節軟骨剝離出，然后用眼科剪把軟骨組織塊盡量剪碎為1 mm×1 mm×1 mm碎片，加入0.25%胰蛋白酶2 ml置于37 ℃恒溫箱消化30～60 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化。巴氏吸管輕輕吹打軟骨組織碎片懸液，以500 r/min低速離心后吸出上層液體并加入0.2%Ⅱ型膠原酶(用10%胎牛血清DMEM溶解)吹打充分混勻，繼續放在37 ℃恒溫箱里消化5 h后以1500 r/min離心收集底層軟骨細胞，加入等體積DMEM終止消化，吹打混勻后用100 μm濾網過濾掉體積較大的軟骨塊，獲得有軟骨細胞的懸濁液。加入適量PBS潤洗2～3遍，加入15 ml 10%胎牛血清DMEM，用巴氏吸管轉移到T75培養盒中，顯微鏡下觀察軟骨細胞密度后放入含5% CO2的37 ℃細胞培養箱。隔天更換新鮮培養基，待細胞長至培養盒90%以上時，按1∶3比例傳代，第3代軟骨細胞用于后續實驗。

1.3.2 PRP與Furin激動劑對LPS軟骨細胞模型的干預：將T75培養盒中原有培養液倒去，用PBS漂洗2次，加入0.25%胰酶消化細胞，觀察細胞消化情況。待細胞變圓后吸去胰酶，加入10%胎牛血清DMEM培養基，將細胞吹打為單細胞懸液，將細胞混勻。將軟骨細胞按一定比例進行分盤，加入適量培養基放入含5% CO2的37 ℃細胞培養箱中。當細胞處于對數期時，調整細胞濃度為1×105個/ml，接種于6孔培養板中，每孔2 ml，過夜培養。待細胞貼壁后，除對照組外，每組給予10 μg/ml的LPS誘導刺激24 h后棄掉培養液，制作軟骨細胞損傷模型，然后按組分別給予5% PRP、10% PRP、20% PRP、Furin激動劑(1 mg/ml)作用24 h。24 h后，收集細胞上清，以3000 r/min離心20 min，取上清，待做酶聯免疫吸附實驗(ELISA)。細胞用TRIzol置于冰上裂解后提取RNA，待做PCR。

1.3.3 ELISA檢測相關炎癥因子表達：各組軟骨細胞培養24 h后，以3000 r/min離心20 min后取上清液，按照ELISA法檢測試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等炎癥因子水平。

1.3.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測相關基因mRNA表達：采用TRIzol提取試劑盒抽提細胞內總RNA，采用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，進行PCR。等待PCR擴增期間，RT-PCR儀可設置為自動分析數據結果，根據陰性對照調整閾值和基線以確定各標本Ct值，并根據熔解曲線確定該Ct值是否有效。導出有效結果后，用2-△△CT法分析目的基因在對照組和各實驗組間的表達差異。目的基因包括基質金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-13、IL-6、ADAMTS-4、ADAMTS-5、IL-1β和環氧化酶(COX)-2、聚蛋白多糖(ACAN)和Ⅱ型膠原A1(COL2A1)。

2 結 果

2.1 各組大鼠膝關節大體觀 見圖1。對照組膝關節關節面不光滑并且有骨贅增生和炎癥浸潤。實驗組關節面光滑、周圍無炎癥浸潤。假手術組總體無明顯變化。

圖1 各組大鼠膝關節大體觀

2.2 各組大鼠膝關節HE、番紅固綠和甲苯胺藍染色結果 見圖2。對照組軟骨細胞結構部分被破壞，關節表層粗糙、不連續，部分軟骨細胞排列紊亂，可見軟骨層有炎癥浸潤及組織變性、壞死、增殖等。假手術組膝軟骨層光滑完整，沒有炎癥細胞浸潤，軟骨細胞外基質完整。實驗組軟骨光滑、完整、連續，軟骨細胞大部分都排列整齊，炎癥細胞浸潤較少，軟骨細胞外基質比較完整。

圖2 各組大鼠膝關節HE、番紅固綠和甲苯胺藍染色結果(×40)

2.3 各組大鼠膝關節免疫組化染色結果 見圖3。本研究中，ADAMTS-5和IL-1β兩種抗體均在免疫組化染色中有陽性表現。

2.4 SD大鼠軟骨細胞經不同處理后相關炎癥因子濃度變化 見圖4。ELISA結果顯示，加入LPS后，IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS濃度顯著增加(均P<0.05)。加入不同濃度PRP后，各炎癥因子濃度隨著PRP濃度的增加呈下降趨勢(均P<0.05)。加入Furin激動劑后，各炎癥因子濃度亦有所下降(均P<0.05)。

2.5 SD大鼠軟骨細胞經不同處理后相關基因表達變化 見圖5。RT-PCR結果顯示，加入LPS后，MMP-3、MMP-13、IL-6、ADAMTS-4、ADAMTS-5、IL-1β和COX-2的mRNA表達增加，ACAN和COL2A1的mRNA表達下降(均P<0.05)。加入不同濃度PRP和Furin激動劑后，上述指標有所修復。

圖5 SD大鼠軟骨細胞經5種不同處理后9種相關基因表達變化注：各圖橫坐標中，A為SD大鼠軟骨細胞，B為SD大鼠軟骨細胞+LPS，C為SD大鼠軟骨細胞+LPS+5% PRP，D為SD大鼠軟骨細胞+LPS+10% PRP，E為SD大鼠軟骨細胞+LPS+20% PRP，F為SD大鼠軟骨細胞+LPS+Furin激動劑。與A比較，*P<0.05，△P<0.01；與B比較，#P<0.05，▲P<0.01

3 討 論

KOA在臨床骨科中屬于常見的軟骨退行性疾病，膝關節軟骨進行性退化和關節周圍組織炎癥是其主要的病理特征[11]。KOA好發于中老年人群，其關鍵的臨床癥狀是疼痛、腫脹、限制性活動等。KOA的發病基礎是關節軟骨基質合成與分解的失衡。所以，治療KOA的關鍵還是要促進關節軟骨修復，調節軟骨基質的平衡[12]。如今大部分的KOA患者都采取保守治療方案，如透明質酸和糖皮質激素等藥物關節內注射[13]。近年來，醫療和科研工作者通過共同努力給我們帶來的PRP療法起到相當好的作用，并且經濟，無免疫排斥反應，但是其中的具體機制研究不是很完善。Wu等[14]通過進行PRP對新西蘭大白兔軟骨細胞活力影響的基礎性研究，推測PRP可能抑制了Wnt/β-catenin信號轉導通路，從而激活軟骨細胞增殖與抑制軟骨細胞炎性反應和退行性病變。PRP在激活以后,主要釋放一些如白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1RA)、腫瘤壞死因子受體(TNF-R)Ⅰ和Ⅱ等抗炎因子，IL-1RA可通過阻滯IL-1R抑制IL-1活化，TNF-R Ⅰ、Ⅱ可通過與TNF-α結合而阻止與之相關的信號通路的傳導[15]。本研究探討了PRP和Furin激動劑對LPS誘導的關節軟骨細胞損傷和大鼠骨關節的保護作用，結果表明PRP和Furin激動劑均可以有效地緩解KOA的發展。

PRP是自身全血經過兩次高速離心萃取來的高濃度血小板，最終提取的PRP血小板濃度是全血血小板濃度的3～5倍。PRP在機體內可發揮重要作用，主要是由于其含有大量血小板生長因子、少量白細胞和纖維蛋白，它們共同發揮最佳的軟骨再生、修復和對炎癥因子清除的作用[16]。到目前為止，PRP的制備主要受到其提取手法、保存方式、激活時間等多種不同因素的影響，其標準很難統一，造成不同制備方法間PRP收集濃度有所差異，從而導致臨床療效不一致。研究發現，二次差速離心方法能為臨床應用提供質量最佳的PRP。Veronesi等[17]研究發現，新鮮提出的PRP比冷凍后儲存后的PRP更有優勢。血小板的體積問題也會影響到其活性，如果血小板自身體積比較大則可以含有更多α顆粒，所以其生物活性與反應能力都是更強的。而且血小板最適濃度、其中白細胞和紅細胞含量都會對療效有不同程度的影響[18]。也有研究[19]顯示PRP可能會對年輕人或者關節病理侵害輕的患者有較好的治療效果。因此，很多因素都可以影響PRP質量，這恰恰也是臨床療效產生差異性的關鍵問題。

Furin作用底物豐富，包括信號肽、細菌毒素和病毒融合肽、生長因子、離子通道、激素、跨膜受體、細胞外基質蛋白和血清蛋白等[20]。而Furin激動劑可以激活體內的Furin，使之參與體內多種生物活動的調節，所以我們用的Furin激動劑在骨關節炎中對維持軟骨內環境穩態及代謝有重要意義。在我們的研究中PRP和Furin激動劑作用于SD大鼠KOA，通過體內外實驗共同驗證它們對關節軟骨的正向修復作用，進而緩解KOA病程的發展。

綜上所述，PRP和Furin激動劑對SD大鼠KOA均有明顯的緩解作用。但本研究也存在不足之處，對于其中治療機制的驗證手段不是很充分，PRP的制備方法也沒采用統一標準，后續將加以完善，繼續更深層次的研究。