支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒糖皮質(zhì)激素受體α、β mRNA表達(dá)檢測及其與血清炎癥因子、肺功能相關(guān)性分析

謝 勇，郭麗麗

(1.榆林市星元醫(yī)院兒科，陜西 榆林 719000；2.榆林市第一醫(yī)院兒科，陜西 榆林 719000)

支氣管哮喘的主要特征是患者氣道出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)，好發(fā)于兒童，是威脅兒童健康的常見疾病之一，臨床癥狀表現(xiàn)為氣急、咳嗽、胸悶等，均易反復(fù)發(fā)作[1]。目前該病的發(fā)生機制還不明確，不過近年來有關(guān)病原體感染與支氣管哮喘發(fā)病關(guān)系的研究得到廣泛重視。肺炎支原體是一種原核細(xì)胞型、無細(xì)胞壁的微生物，不需要細(xì)胞培養(yǎng)基，通過呼吸道飛沫和直接接觸傳播，能獨自胞外生長[2-3]。現(xiàn)代研究[4-5]表明，支氣管哮喘合并肺炎支原體感染發(fā)病的關(guān)鍵機制是Th1/Th2平衡失調(diào)，因此該疾病屬于一種免疫失衡性疾病。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的類同醇類內(nèi)分泌激素，能介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的激活和淋巴因子的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)、快速控制支氣管哮喘癥狀的作用[6-7]。GC在體內(nèi)主要與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)特異性結(jié)合才能發(fā)揮作用，后者屬于核受體超家族的一個亞家族[8]。GR在有核細(xì)胞中廣泛表達(dá)，從而在機體代謝、分化及發(fā)育中發(fā)揮重要作用[9-10]。GR主要有2個亞型，即GR-α和GR-β。本研究主要探討支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒GR-α和GR-β mRNA的表達(dá)情況，并分析其與血清炎癥因子、肺功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年2月到2021年4月我院接診的支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒、單純支氣管哮喘患兒及同期體檢健康的兒童各54例，分別納入合并組、單純哮喘組和對照組。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：合并組患兒均符合支氣管哮喘合并肺炎支原體感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)；單純哮喘組患兒均符合支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡1～8歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)性疾病；有過敏性疾病史；免疫功能低下；低出生體重；先天性氣道畸形。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施。患兒家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

表1 三組一般資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 GR-α、GR-β mRNA表達(dá)檢測：采集所有兒童的咽拭子樣本，按核酸同步抽提試劑盒(批號：48814221，Qiagen公司)要求提取核酸，測定純度及濃度。檢索NCBI Gene Bank數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Bio-Edit軟件設(shè)計GR-α、GR-β引物(GR-α正向序列為5’-CCCAGTGAATCCAGACAAGT-3’，反向序列為5’-GTGTATCCAATCACCTATGAG-3’；GR-β正向序列為5’-CCAAGCTGATCCCAAAGGGAC-3’，反向序列為5’-CCATCGGGCATCCAATITCC-3’)。由大連TAKARA公司進(jìn)行引物合成，采用qPCR方法檢測GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平，以β-actin作為擴增內(nèi)對照組。

1.2.2 血清炎癥因子含量檢測：抽取三組兒童空腹靜脈血2～3 ml，采用EDTA抗凝后在4 ℃條件下以3000 r/min離心10 min，取上清后保存于-80 ℃冰箱。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)等炎癥因子含量使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行檢測(試劑盒批號：28848001、37714222、61975244、89138842，上海生工公司)。

1.2.3 臨床資料調(diào)查：采用自行設(shè)計的統(tǒng)一問卷調(diào)查表，對所有患兒的性別、年齡、體重、身高、吸氣時間、呼氣時間、第一秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1/用力肺活量(FVC)等指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較三組GR-α、GR-β mRNA表達(dá)水平；②比較三組血清炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-13、CRP)表達(dá)水平；③比較三組肺功能指標(biāo)[吸氣時間、呼氣時間、第一秒用力呼氣容積(FEV1)及FEV1/FVC]水平；④分析GR-α、GR-β mRNA表達(dá)與炎癥因子、肺功能的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 三組GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平比較 見表2。合并組與單純哮喘組GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平高于對照組，且合并組高于單純哮喘組(均P<0.05)。

表2 三組GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平比較

2.2 三組血清炎癥因子含量比較 見表3。合并組與單純哮喘組血清TNF-α、IL-6、IL-13含量高于對照組，且合并組高于單純哮喘組(均P<0.05)。三組血清CRP含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 三組血清炎癥因子含量比較

2.3 三組肺功能比較 見表4。合并組與單純哮喘組吸氣時間低于對照組，且合并組低于單純哮喘組(均P<0.05)。三組呼氣時間、FEV1、FEV1/FVC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 三組肺功能比較

2.4 合并組患兒GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平與炎癥因子、肺功能相關(guān)性分析 見表5。Pearson相關(guān)性分析顯示，合并組患兒GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平與血清TNF-α、IL-6、IL-13含量呈正相關(guān)，與吸氣時間呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。

表5 合并組患兒GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平與炎癥因子、肺功能的相關(guān)性

3 討 論

支氣管哮喘是以T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主，伴有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等參與調(diào)節(jié)的氣道慢性、反復(fù)發(fā)作性疾病[11-12]。肺炎支原體為一種非典型病原體，也是患兒呼吸道感染的重要病原體，為導(dǎo)致支氣管哮喘發(fā)作的一個重要因素[13]。GR-α、GR-β屬于核受體超家族的重要成員，都為典型的激素依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要存在于有核細(xì)胞中。GR-α、GR-β為GR基因同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)不同剪切方式而產(chǎn)生，其中GR-α在多數(shù)細(xì)胞中的含量超過GR-β，且GC主要通過結(jié)合GR-α發(fā)揮作用[14]。本研究顯示，合并組與單純哮喘組的GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平高于對照組，且合并組高于單純哮喘組。從機制上分析，GR-α、GR-β表達(dá)增加可使得其與GC的親和力顯著下調(diào)，有利于增加局部淋巴細(xì)胞增殖、活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫損傷，從而使患兒處于免疫紊亂狀態(tài)，導(dǎo)致病情惡化[15-16]。

支氣管哮喘的三大特征是氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣流受限，其中支氣管哮喘的病理基礎(chǔ)是氣道炎癥，因為炎癥因子過量釋放會導(dǎo)致支氣管哮喘的發(fā)生與發(fā)展[17]。IL-6、IL-13由機體內(nèi)的淋巴和非淋巴組織細(xì)胞產(chǎn)生，可參加炎癥介質(zhì)的級聯(lián)反應(yīng)。TNF-α可促進(jìn)形成逐級放大的瀑布樣連鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)組織細(xì)胞損害，因此被認(rèn)為是引起支氣管哮喘的重要細(xì)胞因子之一[18]。本研究顯示，合并組與單純哮喘組的血清TNF-α、IL-6、IL-13含量高于對照組，且合并組高于單純哮喘組。從機制上分析，肺炎支原體感染可通過其特殊結(jié)構(gòu)緊密黏附于一些宿主細(xì)胞膜的受體上，導(dǎo)致機體清除病原體的能力減弱，同時釋放有害的代謝產(chǎn)物，使宿主細(xì)胞受損；并且肺炎支原體感染可影響免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子而參與支氣管哮喘的發(fā)病[19]。

通過肺功能動態(tài)觀察能夠較準(zhǔn)確地評估支氣管哮喘患兒的氣道受損程度，從而減少支氣管哮喘對患兒的危害程度，同時還可以減少支氣管哮喘的發(fā)病率[20]。本研究顯示，合并組與單純哮喘組吸氣時間低于對照組，且合并組低于單純哮喘組；三組呼氣時間、FEV1、FEV1/FVC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。究其原因，肺炎支原體感染可導(dǎo)致機體出現(xiàn)支氣管上皮受損，進(jìn)而出現(xiàn)小氣管收縮，從而降低患兒的吸氣時間。Pearson相關(guān)性分析顯示，支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒的GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平與TNF-α、IL-6、IL-13含量呈正相關(guān)，與吸氣時間呈負(fù)相關(guān)。從機制上分析，支氣管哮喘合并肺炎支原體感染是一種患兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病，也是一種由多種免疫細(xì)胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病。GC可以通過與GR結(jié)合產(chǎn)生抗炎作用。當(dāng)機體突然停用高效GC制劑后，GR與GC的親和力下降，致使內(nèi)源性GC不能很好地發(fā)揮其生物效應(yīng)，引起細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)釋放增加，導(dǎo)致機體容易受到感染侵襲。

綜上所述，支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒多呈現(xiàn)GR-α、GR-β mRNA的高表達(dá)，而GR-α、GR-β mRNA相對表達(dá)水平與患兒血清炎癥因子、肺功能密切相關(guān)。但本研究也有一定的不足，病例人數(shù)比較少，且指標(biāo)相對單一，下一步將增加樣本量和相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行更深入的分析。