赤峰地區(qū)結直腸癌相關KRAS和PIK3CA基因多態(tài)性及臨床意義

李敬楠，白春英，房 芹

(1.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學院附屬醫(yī)院普通外科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.赤峰學院內(nèi)蒙古人類遺傳病研究重點實驗室，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；4.赤峰學院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見惡性腫瘤，早期無明顯癥狀，隨癌腫增大表現(xiàn)為便血、腹瀉及腹痛，晚期表現(xiàn)為貧血、體重減輕[1]。近年來，CRC發(fā)病率逐漸上升，據(jù)統(tǒng)計其發(fā)病率居全球第三位，病死率居第四位，已成為全球的公共衛(wèi)生問題，嚴重威脅人類的健康[2]。近年來，隨著抗表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)靶向治療單抗類藥物的問世，CRC的靶向治療有效延長了患者生存時間，并避免了化療帶來的不良反應[3]。而KARS是EGFR所依賴的下游信號轉導通道中的重要調(diào)控基因，RAS基因通過突變激活RAS蛋白，能夠激活EGFR下游信號因子，導致CRC不能從EGFR單克隆抗體治療中獲益[4]。因此，對存在轉移的CRC，應在使用抗EGFR靶向藥物前檢測RAS基因。但在對抗EGFR靶向藥物無效的患者中約50%是RAS基因突變，這是因為EGFR下游絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路中的BRAF基因和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路中的PIK3CA基因突變后，患者不能從抗EGFR單克隆抗體中獲益，因此在靶向治療前應檢測PIK3CA基因[5]。基于此，本研究探討赤峰地區(qū)CRC患者KRAS和PIK3CA基因多態(tài)性，以及基因突變率與臨床病理特征、血常規(guī)及腫瘤標志物的關系，為個體化、精準化治療提供理論和依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018年1月至2021年6月赤峰學院附屬醫(yī)院收治的CRC患者107例為研究對象，其中男性68例，女性39例；年齡32～80歲，平均(58.23±7.44)歲。病例納入標準：首生結直腸癌變，術前未行任何放化療，術后均進行了基因檢測，并進行了聯(lián)合化療；符合《中國結直腸癌診療規(guī)范(2020)版》[6]中診斷并經(jīng)病理學證實；對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：免疫系統(tǒng)疾?。患毙曰蚵愿腥?；合并其他原發(fā)性腫瘤。同時，選取同期體檢健康者376例為對照組，其中男性231例，女性145例；年齡30～75歲，平均(57.24±6.27)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本制備：切除1 cm×1 cm×1 cm腫瘤組織，福爾馬林溶液固定后石蠟包埋組織，常規(guī)切片(10～15 μm)，共20片，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 KRAS、PIK3CA基因突變檢測：取出其中2～5片切片，間斷使用二甲苯脫蠟，離心處理后提取最上層清液，加入無水乙醇1 ml，然后離心、靜置、沉淀，使用達安樣品DNA分離試劑盒進行組織切片DNA的提取(具體步驟遵從說明書)，測定所提DNA濃度及純度。以調(diào)整出合適濃度的DNA作為模板在熒光定量PCR儀(雅睿MA-6000，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)上進行PCR擴增，使用基因突變聯(lián)合檢測試劑盒(批號：360016-201701，深圳海思安生物技術有限公司)檢測KRAS基因(第2～4外顯子)、PIK3CA基因(20號外顯子)的突變情況，測序結果按相應軟件處理，并與CRC基因庫序列對比分析。PCR反應體系：10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP 3 μl，上下游引物各0.8 μl，LA Taq酶0.1 μl，DNA模板2 μl，無菌水13 μl，反應體系為20 μl。反應條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 25 s，56 ℃退火40 s，72 ℃ 15 s，共46個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.3 血常規(guī)檢測：采集血樣2～3 ml，采用全自動生化分析儀(長春迪瑞CS-1200型)檢測白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板(PLT)、大血小板比率(PLCR)、血小板體積分布寬度(PDW)、血小板比容(PCT)、有核紅細胞(NRBC)、中性粒細胞百分比(NEU%)、平均血小板體積(MPV)、單核細胞百分比(MON%)、平均紅細胞體積(MCV)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、平均血紅蛋白量(MCH)、淋巴細胞百分比(LYM%)、血紅蛋白(Hb) 、血細胞比容(HCT)、嗜酸性粒細胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細胞百分比(BAS%)。

1.2.4 腫瘤標志物檢測：采集晨起空腹肘正中靜脈血3 ml，保存于EDTA抗凝管中，以3000 r/min離心10 min，分離上清后-70 ℃恒溫冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定檢測血清癌胚抗原(CEA)、糖類抗原72-4(CA724)、糖類抗原19-9(CA199)、甲胎蛋白(AFP)。檢測試劑盒(批號：20160909、20160306、20180530、20170912)由中山生物工程有限公司提供。

2 結 果

2.1 KRAS和PIK3CA基因突變情況 107例患者中，KRAS基因突變58例，突變率為54.2%；PIK3CA基因突變26例，突變率為24.3%；KRAS和PIK3CA基因同時突變18例，突變率為16.8%。其余患者未發(fā)生突變。

2.2 KRAS、PIK3CA基因突變與CRC患者臨床病理特征的關系 見表1。KRAS和PIK3CA基因突變與CRC患者性別、年齡、腫瘤部位、病理類型、分化程度、TNM分期及遠處器官轉移無關(均P>0.05)。

表1 KRAS、PIK3CA基因突變與CRC患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.3 KRAS、PIK3CA基因突變與血常規(guī)的關系 見表2。①KRAS突變組和KRAS野生組RBC、PDW、NEU%、MCV、MCH、LYM%、Hb、HCT、BAS%低于對照組(均P<0.05)，而KRAS突變組和KRAS野生組比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。KRAS突變組WBC、PLT高于對照組，而MCHC低于對照組(均P<0.05)，而KRAS野生組和對照組比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。三組PLCR、PCT、NRBC、MPV、MON%、EOS%比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。②PIK3CA突變組、PIK3CA野生組RBC、MCV、MCH、LYM%、Hb低于對照組，NEU%、HCT高于對照組，且PIK3CA突變組MCHC、Hb低于PIK3CA野生組(均P<0.05)，其余比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。PIK3CA突變組PCT高于對照組，MCHC低于對照組(均P<0.05)，而PIK3CA野生組和對照組比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。PIK3CA野生組PDW、BAS%低于對照組(均P<0.05)，PIK3CA突變組和正常對照組比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。三組WBC、PLT、PLCR、NRBC、MPV、MON%、EOS%比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。

表2 KRAS、PIK3CA基因突變與血常規(guī)的關系

2.4 KRAS、PIK3CA基因突變與腫瘤標志物的關系 見表3。①KRAS突變組CEA、CA724、CA199高于對照組，CA199高于KRAS野生組(均P<0.05)。三組AFP比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組和KRAS野生組CEA、CA724、CA199、AFP比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。②PIK3CA突變組和PIK3CA野生組CEA高于對照組，但PIK3CA突變組與PIK3CA野生組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PIK3CA野生組CEA、CA724、CA199高于對照組，AFP低于對照組(均P<0.05)，但PIK3CA突變組和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表3 KRAS、PIK3CA基因突變與腫瘤標志物的關系

3 討 論

目前，CRC病因尚未完全清楚，但有研究[7]證實CRC的發(fā)生發(fā)展與飲食、生活方式等環(huán)境因素及遺傳因素相關。更有學者認為CRC發(fā)病的遺傳因素與地域差異有關[8]。手術切除是早期CRC的治療手段，但對發(fā)生轉移者常輔助藥物化療。近年來，潛在分子序列已被發(fā)現(xiàn)，較為常見的是EGFR單克隆抗體，針對于該受體研究的靶向治療藥物使得CRC的治療步入個體化、精準化時代，患者生存率得以提高，同時可避免普通化療帶來的不良反應，提升了患者生存質量[9-10]。而CRC是多基因突變作用的結果，所以導致不同個體對靶向藥物治療反應差異較大，因此預測不同個體對靶向藥物的反應可避免過度治療，同時減少患者不必要的經(jīng)濟負擔[11]。

KRAS基因是EGFR信號轉導通路中下游調(diào)控基因。研究[12]表明，KRAS基因突變在CRC中占30%～40%，攜帶KRAS基因突變者會對西妥昔單抗或帕尼單抗產(chǎn)生耐藥。這與KRAS基因突變導致EGFR信號轉導通路激活有關，因此對于KRAS基因突變的CRC不考慮抗EGFR靶向藥物治療[13]。此外，能夠使EGFR信號轉導通路獨立且激活的因素會導致CRC對分子靶向藥物產(chǎn)生耐藥，而EGFR信號轉導系統(tǒng)下游通路中的NRAS、BRAF、PIK3CA基因突變會導致EGFR信號轉導通路持續(xù)激活，所以對KRAS野生型基因CRC約30%～40%會對抗EGFR靶向藥物產(chǎn)生應答并取得療效，這可能與NRAS、BRAF、PIK3CA基因突變有關[14]。PIK3CA是編碼EGFR的下游效應蛋白p110a激酶，其基因突變在5.6%～18%的CRC中被報道，可與RAS和BRAF基因突變共存，80%以上的PIK3CA基因突變發(fā)生在第9、20外顯子[15]。PIK3CA突變可激活p110a蛋白激酶，進而激活EGFR下游信號通路，誘導腫瘤發(fā)生及生長[16]。有研究[17]顯示，攜帶PIK3CA基因20外顯子突變的CRC患者反應率低于攜帶PIK3CA基因野生型者，且PIK3CA基因20外顯子突變與較短的無進展生存期呈正相關。因此，PIK3CA基因20外顯子的突變可預估對西妥昔單抗或帕尼單抗是否產(chǎn)生耐藥。本研究結果顯示，KRAS基因突變率為54.2%，PIK3CA基因突變率為24.3%，提示赤峰地區(qū)CRC患者KRAS、PIK3CA基因突變率較高，考慮與赤峰地區(qū)所處內(nèi)蒙古的地理環(huán)境及族群生活習性有關；KRAS、PIK3CA基因同時突變率為16.8%，提示CRC患者存在PIK3CA、KRAS基因雙突變，因此臨床應對兩者進行檢測。分析其與臨床病理特征的關系發(fā)現(xiàn)，KRAS和PIK3CA基因突變與性別、年齡、腫瘤部位、病理類型、分化程度、TNM分期及遠處器官轉移無關。而蔣洪波等[18]研究顯示，CRC患者KRAS基因突變與性別、腫瘤部位有關。白楊等[19]研究顯示，CRC患者PIK3CA基因突變與性別、年齡和病理分期均無關。本研究與上述研究略有不同，考慮與樣本量、地區(qū)個體差異等有關。

外周血常規(guī)檢查是臨床上較理想且簡便的檢測手段，可作為評估CRC病情發(fā)展的指標，因此本研究分析血常規(guī)與KRAS、PIK3CA基因突變的關系，結果顯示KRAS突變組和KRAS野生組RBC、PDW、NEU、MCV、MCH、LYM%、Hb、HCT、BAS%低于對照組，KRAS突變組WBC、PLT高于對照組，MCHC低于對照組；PIK3CA突變組和PIK3CA野生組RBC、MCV、MCH、LYM%、Hb低于對照組，NEU%、HCT高于對照組，且PIK3CA突變組MCHC、Hb低于PIK3CA野生組；PIK3CA突變組PCT高于對照組，MCHC低于對照組，PIK3CA野生組PDW、BAS%低于對照組，提示RBC、PDW、NEU%、MCV、MCH、LYM%、Hb、HCT、BAS%與KRAS和PIK3CA基因突變有關，臨床上可將其作為CRC的初篩指標，但特異性較低，因此需結合其他檢查確診。

近年來，腫瘤標志物已用于腫瘤的診斷。CEA、CA724、CA199、AFP為臨床常見腫瘤標志物，其中CEA是廣泛性腫瘤標志物，存在于消化系統(tǒng)腫瘤血清中，是篩查和診斷癌細胞復發(fā)、轉移的標志物；CA724屬于黏蛋白類癌胚抗原，是檢測消化道腫瘤的標志物；CA199可用于消化道腫瘤的特異性診斷；AFP是診斷原發(fā)性肝癌最敏感的指標，現(xiàn)已用于診斷、評估療效及判斷復發(fā)[20]。因此，本研究分析其與KRAS、PIK3CA基因突變的關系，結果顯示KRAS突變組血清CEA、CA724、CA199水平高于對照組，CA199高于KRAS野生組；PIK3CA突變組和PIK3CA野生組CEA高于對照組，PIK3CA野生組血清CEA、CA724、CA199水平高于對照組，AFP低于對照組，提示赤峰地區(qū)CEA、CA199升高可作為CRC的主要篩查指標，CA724升高在一定程度上反映了KRAS基因突變的可能，而AFP在排除其他干擾因素影響下顯著降低，加之CEA、CA724、CA199的顯著升高，有助于判斷CRC患者PIK3CA基因是否處于野生狀態(tài)的可能。

綜上所述，赤峰地區(qū)CRC患者KRAS、PIK3CA基因突變率較高，且與RBC、PDW、NEU%、MCV、MCH、LYM%、Hb、HCT、BAS%及血清CA199、CEA水平有關，可作為CRC的篩查指標，且聯(lián)合檢測KRAS、PIK3CA基因對指導臨床制定治療方案具有重要意義。同時，臨床應對RBC、PDW、NEU%、MCV、MCH、LYM%、Hb、HCT、BAS%以及血清CA199、CEA水平進行監(jiān)測，以提高CRC檢出率。