神經干細胞促進大鼠局部神經元降鈣素基因相關肽生成及脊柱骨折愈合機制研究

李 鵬，李曉博，王林欽

(1.安康市人民醫院脊柱外科，陜西 安康 725000；2.西北婦女兒童醫院骨科，陜西 西安 710061)

脊柱骨折會對中樞神經系統(Central nervous system，CNS)造成損傷，導致損傷水平以下由脊髓支配的身體部位的肌肉功能、感覺或自主功能發生暫時或永久性變化[1-2]。目前，脊髓損傷沒有有效的治療方法，主要是因為成人CNS中的大多數神經元都是終末分化的，受傷后無法再生。研究[3-4]表明，脊柱骨折引起的骨丟失是骨形成受到抑制和骨吸收增加所致。其病因復雜，其中缺乏機械刺激和營養不足被認為是脊柱骨折相關性骨質疏松癥發生的重要原因[5-6]。目前可用的非藥物療法主要是對骨骼施加機械力(如站立、輔助行走和體育鍛煉)，而療效仍有爭議[7-8]。此外，這些方法對于大多數脊柱骨折患者來說，不方便且難以實施。最近在一些成熟的CNS區域(如脊髓)中發現了少量的神經干細胞(Neural stem cells，NSC)。神經元和NSC的損傷后修復和再生對于脊髓損傷的治療至關重要。NSC可以在體外維持在積極增殖狀態，并能夠分化為成熟的神經元和神經膠質，是用于移植修復受損的CNS的理想種子細胞[9-10]。用于治療脊柱骨折的NSC移植已成為一種越來越有吸引力的策略。降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)是一種含37個氨基酸的肽，主要在背根神經節和脊髓腹角合成，其沿著軸突運輸到全身感覺神經纖維的外周和中央末端，在脊髓中濃度最高。CGRP在修復組織、激活其同源G蛋白偶聯受體及啟動細胞內信號傳導方面發揮著關鍵作用。在脊柱周圍等組織損傷后，CGRP參與血管舒張、感覺傳遞、免疫調節和神經再生。本研究通過建立脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)模型探討NSC促進大鼠局部神經元中CGRP生成和脊柱骨折愈合的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體重180～220 g的30只成年SD雄性大鼠購自陜西省中醫藥研究院食品化妝品檢驗檢定中心，許可證號：SYXK(陜)2018-009。所有動物都被安置在空氣過濾、濕度控制的房間中，12 h光照/12 h黑暗循環，室溫下飼養。所有動物實驗方案均經大學實驗動物護理和使用倫理委員會批準，并按照動物福利國際標準和中國動物福利立法進行。

1.2 主要試劑 胰高血糖素酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(批號：PG357)購自上海碧云天生物科技有限公司；蛋白定量檢測試劑盒(批號：23227)購自美國Thermo Fisher公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗大鼠IgG一抗和二抗(批號：ab6734、ab6734)購自英國Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SCI建模與分組：使用水合氯醛腹膜內注射麻醉大鼠，在T8-9椎體水平切除椎板，使用手術刀片完全橫斷脊髓或用改良的動脈瘤鉗擠壓1 s，施加180 g(大約1.77 N)閉合力。將3 mm×3 mm×3 mm的明膠海綿放入窗孔中進行充分止血。將一個由Ⅰ型膠原蛋白制成的支架切割成約2 mm×2 mm×2 mm大小，作為移植細胞的載體填充到腔中。將大鼠分為對照組(不進行任何手術和細胞移植)、脊柱骨折組(如前所述建立SCI模型，將無任何細胞的培養基支架移植到橫斷的脊髓中)和神經干細胞組(在SCI基礎上顯微注射5 ml NSC懸浮液)，每組10只。閉合手術切口后，將大鼠送回到飼養籠，給予廣泛護理，包括腹腔內注射青霉素[50000 U/(kg·d)]3 d。

1.3.2 損傷脊髓神經營養素-3(NT-3)和CGRP水平檢測：采用ELISA檢測受損脊髓組織蛋白樣品中的NT-3和CGRP水平。D(λ)值(波長=450 nm)通過酶標儀測量。繪制標準曲線并計算受傷脊髓組織中NT-3和CGRP的含量。

1.3.3 相關蛋白表達檢測：采用Western blot檢測各組大鼠巢蛋白(Nestin)、CGRP和神經元核心抗原(NeuN)蛋白表達情況。獲得每只大鼠T10脊髓并在冰上勻漿，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白質，并根據制造商說明使用BCA試劑盒進行定量。通過SDS-PAGE電泳分離等量總蛋白(30 μg)并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下將膜在含有5%脫脂牛奶和0.1% Tween-20的TBS緩沖液中封閉 2 h，并與適當的一抗(1∶1000)在4 ℃條件下孵育過夜。將膜用TBST洗滌并與HRP標記兔抗大鼠二抗(1∶5000)在37 ℃條件下孵育2 h。用 TBST徹底清洗膜，每次5 min，然后進行ECL檢測。通過凝膠成像儀檢測條帶的強度，并通過Image Lab 2.0軟件分析條帶的灰度值。

1.3.4 尼氏染色與神經元計數：取自每只大鼠L1段的50個連續脊髓切片用中性紅染色，每6個連續選擇1個。基于立體學原理，在配備網格的顯微鏡下計數錐體外系和內錐體層內的神經元密度。計數每只大鼠L1節段50個連續脊髓切片中L1脊髓節段處的整個神經元數。計算錐體外系和內錐體層神經元密度。但是L1脊髓節段的域很窄，一個切片中的L1脊髓節段神經元很少。為了獲得有價值的結果，對每只大鼠L1脊髓節段50個連續切片中L1脊髓節段的全神經元數進行計數。

1.3.5 骨轉換血清標志物檢測：采集血液后立即以12000 r/min 離心5 min，將上清液儲存于-80 ℃。使用商業ELISA試劑盒測量骨鈣素(OC)和Ⅰ型前膠原氨基端延長肽(P1NP)N末端前肽作為骨形成標志物。然后檢測骨吸收標志物的血清水平，包括抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP-5b)和Ⅰ型膠原交聯C-末端肽(CTX-1)。所有血清測量均根據制造商推薦的程序進行。

1.3.6 顯微結構指標分析：使用高分辨率顯微CT掃描左側股骨以獲得三維骨骼微結構。參數設置：電壓80 kV，電流80 μA，曝光時間2.96 s，旋轉角210°，旋轉步長0.4°。基于獲得的2D圖像重建3D圖像，各向同性體素大小為16 μm。使用Vgstudio Max 2.2軟件對骨小梁和皮質骨結構進行定量分析。對于骨小梁特性，選擇感興趣體積(VOI)，從干骺端生長板近端0.4 mm開始，向近端延伸2.4 mm。計算小梁顯微結構指標，包括小梁骨礦物質密度(BMD)、每總體積的骨體積(BV/TV)、連接密度(Conn.D)、小梁數(Tb.N)以及小梁厚度(Tb.Th)。對于皮質骨的分析，選擇另一個1.6 mm高度的股骨中骨VOI以獲得皮質厚度(Ct.Th)。

1.3.7 骨組織形態學檢查：采用TRAP染色檢測大鼠骨組織成骨細胞數量，經脫水、石蠟包埋、切片后，用去離子水清洗切片，于37 ℃避光孵育1 h，顯微鏡下觀察成骨細胞數量。將嵌入微鏡陣列中的左股骨標本縱向切開至50 μm，使用熒光顯微鏡可視化鈣黃綠素熒光染料標記。將股骨干骺端遠端生長板近端1～3 mm區域定義為動態骨小梁組織形態測量分析的VOI。計算礦物沉積率(MAR)、骨形成率/骨表面(BFR/BS)和成骨細胞數量/骨表面(N.Ob/BS)。

2 結 果

2.1 三組大鼠NT-3和CGRP水平比較 見表1。脊柱骨折組NT-3和CGRP水平較對照組降低，神經干細胞組NT-3和CGRP水平較脊柱骨折組升高(均P<0.05)。

表1 三組大鼠NT-3和CGRP水平比較(μg/g)

2.2 三組大鼠Nestin、CGRP和NeuN蛋白相對表達量比較 見表2。脊柱骨折組Nestin蛋白表達較對照組升高，神經干細胞組Nestin蛋白表達較脊柱骨折組升高(P<0.05)。脊柱骨折組CGRP和NeuN蛋白表達較對照組降低，神經干細胞組CGRP和NeuN蛋白表達較脊柱骨折組升高(均P<0.05)。

表2 三組大鼠Nestin、CGRP和NeuN蛋白相對表達量比較

2.3 三組大鼠神經元存活情況比較 見表3。脊柱骨折組錐體外系、內錐體層和L1脊髓節段處神經元數量較對照組減少，神經干細胞組錐體外系、內錐體層和L1脊髓節段處神經元數量較脊柱骨折組增多(均P<0.05)。

表3 三組大鼠神經元存活情況比較

2.4 三組大鼠骨轉換血清標志物水平比較 見表4。脊柱骨折組骨鈣素和P1NP水平較對照組降低， TRAcP-5b和CTX-1水平較對照組升高(均P<0.05)。神經干細胞組骨鈣素和P1NP水平較脊柱骨折組升高，TRAcP-5b和CTX-1水平較脊柱骨折組降低(均P<0.05)。

表4 三組大鼠骨轉換血清標志物水平比較

2.5 三組大鼠骨骼顯微結構指標比較 見表5。脊柱骨折組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Ct.Th較對照組減小，神經干細胞組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Ct.Th較脊柱骨折組增加(均P<0.05)。

表5 三組大鼠骨骼顯微結構指標比較

2.6 三組大鼠骨組織形態指標比較 見表6。脊柱骨折組MAR、BFR/BS和N.Ob/BS較對照組降低，神經干細胞組MAR、BFR/BS和N.Ob/BS較脊柱骨折組升高(均P<0.05)。

表6 三組大鼠骨組織形態指標比較

3 討 論

脊柱骨折是一種極其嚴重的神經損傷，可導致身體功能嚴重喪失[11-12]。然而，當前治療方法的療效在很大程度上受到限制。研究[13-15]表明，脊柱骨折后神經系統的功能恢復受原發性損傷和繼發性細胞萎縮、壞死和凋亡導致的局部神經細胞丟失的影響，神經細胞特別是神經元和NSC的修復和再生對神經功能的恢復至關重要。無法替換受損或死亡的神經元被認為是嚴重阻礙CNS損傷療法發展的主要原因之一。胎兒組織成功植入受傷的CNS表明神經元替代是CNS修復的一種有價值的策略。NSC是很好的候選者，可以在組織培養中進行克隆擴增，并為移植提供可再生的材料供應。NSC可合成多種神經營養因子、細胞黏附和細胞外基質分子[16-18]。

CGRP是廣泛分布于外周和中樞神經系統，可促進神經再生，并參與SCI后修復過程。CGRP的持續表達與神經再生密切相關。該機制可能與其對神經系統血液供應的促進作用有關。目前，CGRP是已知最強的血管擴張物質。隨著進一步的研究，它對骨代謝的調節作用正變得越來越清晰。相關研究證明，CGRP通過感覺神經大量分布在骨骼中，特別是在骨骺小梁骨中。據報道，CGRP由成骨細胞內源性表達。具有過度表達CGRP的成骨細胞的轉基因小鼠的特點是骨形成速率增加和骨體積增加，這表明CGRP確實不僅通過神經途徑，而且通過自分泌環作用于骨代謝。眾所周知，NSC在SCI的修復中發揮著重要作用。Nestin是一種NSC特異性Ⅳ型中間絲蛋白，是NSC正確自我更新所必需的，并且與NSC密切相關。NSC生物標志物Nestin在活躍增殖的NSC中高度表達。Nestin的表達在成熟神經元和神經膠質細胞中減少，但在受損的神經組織中增加。因此，與對照組相比，在SCI模型大鼠中Nestin的表達升高。NeuN是一種小的可溶性蛋白，主要分布在神經元的細胞質和細胞核中。作為NSC的生物標志物，NeuN蛋白的表達水平表明了細胞的增殖能力。NT-3是重要的神經營養因子之一，可防止成熟CNS神經元的萎縮，促進脊髓損傷動物的皮質脊髓束軸突再生和后肢功能的恢復。本研究中發現，神經干細胞治療可刺激Nestin、NeuN、NT-3和CGRP的表達，提示干細胞移植促進了神經元的再生。

由于脊髓不僅包含大量的神經元，而且還包含大量的上行和下行神經纖維，因此脊髓橫斷會導致所有神經纖維被切斷[19-20]，因此擁有神經纖維的神經元受到傷害。在本研究中，我們選擇了一些具有代表性的區域來探索受損神經元的存活情況，發現在脊柱骨折大鼠的錐體系統、錐體外系和L1脊髓節段的神經元數量減少，而經過NSC治療后得到增加，因此其可以促進移植的干細胞衍生神經元和脊髓神經元的存活。脊髓損傷患者的骨骼發生了深刻的變化，其特點是骨質流失迅速，骨折風險顯著增加。研究表明，干細胞移植有可能成為一種有前途的治療方法，可促進新鮮/延遲骨折愈合，且無明顯不良反應。

本研究發現，NSC通過拯救SCI大鼠的成骨細胞和骨細胞介導的骨合成代謝來保持松質骨和皮質骨量、微結構。眾所周知，SCI患者的骨小梁量顯著減少，尤其是在股骨遠端和脛骨近端。顯微CT結果顯示，SCI可導致小梁骨量和骨微結構的有害改變，包括小梁數量、厚度和連接性受損。同樣，也有研究觀察到SCI后動物的嚴重松質骨退化，而NSC治療幾乎可以將SCI大鼠的小梁數量、分離和體積分數恢復到對照組大鼠的水平。此外，由SCI引起的骨小梁連接性和厚度的惡化也被干細胞部分抑制。我們還發現，SCI誘導大鼠皮質骨變薄，這與之前的報道一致。NSC治療部分減輕了SCI大鼠皮質厚度的惡化，揭示了骨骼機械完整性和斷裂韌性的潛在改善。已知SCI后的骨丟失與骨代謝不平衡、骨形成減少和骨吸收加速有關。血清骨鈣素和 P1NP 作為骨形成的兩種敏感和可靠的生化標志物，在本研究中被發現在SCI大鼠中顯著降低。另外，SCI大鼠血清TRACP-5b和CTX-1(兩種特異性骨吸收生物標志物)增加。NSC幾乎將SCI大鼠的血清骨鈣素和 P1NP水平恢復到控制水平，支持干細胞誘導的強合成代謝作用。鈣黃綠素雙標記結果提供了更直接的證據，表明NSC治療保留了SCI大鼠的骨形成。骨組織學結果表明，NSC除了提高SCI大鼠的骨形成率外，還增加了骨表面的成骨細胞數量。

綜上所述，神經干細胞療法能促進局部神經元中CGRP生成和神經元的存活，從而促進SCI大鼠骨折愈合和功能恢復。