YTHDF基因DNA甲基化與乙肝疫苗低/無免疫應答水平關系研究

蘇永健，陳夢麗，李嘉鈴，張家瑋，趙文文，陳欽艷，胡莉萍，王 超，李 海，董柏青

(1.廣西中醫藥大學公共衛生與管理學院流行病學教研室，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學廣西高發傳染病中西醫結合轉化醫學重點實驗室，廣西 南寧 530200；3.廣西壯族自治區疾病預防控制中心廣西病毒性肝炎防治研究重點實驗室，廣西 南寧 530029；4.廣西中醫藥大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，廣西 南寧 530200)

據世界衛生組織估計，2019年全球慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)患者約2.96億，每年新增感染150萬，因CHB死亡約82萬(其中大部分來自肝硬化和肝癌)，可見乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染給全球人類的健康帶來沉重的負擔和嚴峻的挑戰。我國自1992年將乙肝疫苗普遍接種納入計劃免疫規劃以來，普通人群乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)陽性率呈現明顯下降趨勢[1-2]，尤其是5歲以下兒童HBsAg陽性率已降到1%以下[3]。但仍有5%～10%的人群(包括部分嬰幼兒和成人)在接種乙肝疫苗后發生低/無免疫應答現象[4]。研究[5]表明，影響乙肝疫苗免疫應答水平的因素很多，但最主要的是宿主遺傳因素。在表觀遺傳學研究中，DNA甲基化對基因表達的調控起著重要作用[6]。基因位點與DNA甲基化水平有關[7]。YTHDF基因屬于N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)結合蛋白YTH同源結構域蛋白家族，能夠識別發生m6A修飾的堿基[8]。目前研究表明，YTHDF基因可促進原發性肝癌和炎癥的發生與發展[9-11]，但對于宿主YTHDF基因DNA甲基化水平是否會影響RNA的轉錄調控和蛋白表達，從而影響m6A修飾，導致免疫分子表達異常和乙肝疫苗免疫低/無免疫應答的發生，目前尚未明確。本研究擬通過探討YTHDF基因位點DNA甲基化與廣西壯族自治區漢族兒童乙肝疫苗低/無免疫應答水平間的關系，為預測個體乙肝疫苗免疫應答水平和研發新型乙肝疫苗提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 從廣西三所三級甲等醫院(南寧市第一人民醫院、南寧市婦幼保健院和廣西壯族自治區婦幼保健院)選取2016年1月至2016年12月就診的8～9月齡廣西漢族兒童263例為研究對象。納入標準：①兒童父母雙方均為漢族；②兒童已按照0-1-6免疫程序全程接種3針乙肝疫苗；③兒童無任何肝臟疾病，且肝功能正常；④兒童乙肝血清標志物檢測結果中，除乙型肝炎表面抗體(Hepatitis B surface antibody，anti-HBs)陽性外，其余四項檢測結果均為陰性；⑤兒童HBV-DNA檢測結果呈陰性；⑥兒童沒有罹患先天性或基礎性疾病或全身系統性疾病。若以上標準有1條或多條不符合則予以排除。本研究已通過廣西倫理審查委員會審查和備案(IRB SQ/01.01/02)，研究對象父母已得到充分告知并簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 研究設計：參考Krawczyk等[12]文獻，將研究對象的anti-HBs滴度分為4個水平：①高應答水平，anti-HBs≥1000 mIU/ml；②正常應答水平，100 mIU/ml≤anti-HBs<1000 mIU/ml；③低應答水平，10 mIU/ml≤anti-HBs<100 mIU/ml；④無應答水平，anti-HBs<10 mIU/ml。本研究采用非匹配病例對照研究方法，將低/無免疫應答水平(anti-HBs<100 mIU/ml)兒童納入病例組，將正常/高應答水平(anti-HBs≥100 mIU/ml)兒童納入對照組。

1.2.2 血樣采集：研究對象完成乙肝疫苗免疫接種程序后第8周，采集其外周靜脈血10 ml，用于后續實驗。

1.2.3 血樣DNA提取及濃度測定：取5 ml全血，采用Trizol法提取DNA(試劑盒批號：MAN0016385，賽默飛世爾科技公司)。取5 μl擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠圖像成像系統中觀察基因組DNA完整性：電泳條帶清晰可見，無明顯降解和RNA污染。采用超微量分光光度計(型號：Nano Drop 2000，賽默飛世爾科技公司)檢測基因DNA質量：檢測DNA濃度≥20 ng/μl，總量≥1 μg，OD260/280=1.7～2.0，OD260/230≥1.8。

1.2.4 引物設計與單位點PCR條件優化：采用上海天昊科技公司的專利軟件(Methylation Fast Target V4.1)針對目標區域設計和優化多重PCR引物。YTHDF基因引物序列見表1。

表1 YTHDF基因引物序列

1.2.5 重亞硫酸鹽轉化測序技術：采用EZ DNA 甲基化試劑盒(批號：D5005，Zymo Research公司)對DNA進行重亞硫酸鹽處理，將基因組中未被甲基化修飾的DNA胞嘧啶(C)轉變為尿嘧啶(U)。以優化后的多重 PCR引物為模板對經過重亞硫酸鹽轉化后樣本目標片段進行多重PCR擴增。

1.2.6 樣本添加特異性標簽序列與上機測序：通過11個循環數PCR擴增技術將帶有Index序列的引物引入文庫末端并添加特異性標簽序列。將所有樣品Index PCR擴增產物等量混合后割膠回收，獲得Methyl Target測序數據庫。確定產物濃度后以2×150 bp的雙端測序模式通過Illumina Hiseq (型號：Nextseq500，Illumina公司)平臺進行高通量測序并獲得數據。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件對實驗數據進行分析。兩組兒童年齡及性別分布比較采用χ2檢驗。YTHDF基因甲基化水平經正態性檢驗發現不符合正態分布，用中位數(M)和四分位距(IQR)進行描述，采用非參數Mann-WhitneyU檢驗比較組間差異。采用非條件Logistic回歸模型分析兒童乙肝疫苗免疫應答水平和YTHDF基因DNA甲基化水平間的關系，并計算比值比(OR)和95%置信區間(CI)。檢驗水準α=0.05(雙側)。

2 結 果

2.1 兩組兒童年齡和性別分布比較 見表2。本研究共納入263例8～9月齡廣西漢族兒童，其中男性228例(86.7%)，女性35例(13.3%)；乙肝疫苗無、低、正常和高應答者分別為8例(3.0%)、96例(36.5%)、68例(25.9%)和91例(34.6%)。病例組(低/無免疫應答水平)與對照組(正常/高免疫應答水平)年齡和性別分布比較差異無統計學意義(χ2=2.912、0.004，P=0.088、0.953)。

表2 兩組兒童年齡和性別分布比較[例(%)]

2.2 兩組兒童YTHDF基因DNA甲基化水平比較 見表3～5。病例組YTHDF1_1基因23位點、YTHDF1_2基因69位點與YTHDF1_2基因140位點DNA甲基化水平均高于對照組(Z=-2.093、-1.690、-2.356，均P<0.05)。

表3 兩組兒童YTHDF1_1基因不同位點DNA甲基化水平比較[M(IQR)]

表4 兩組兒童YTHDF1_2基因不同位點DNA甲基化水平比較[M(IQR)]

表5 兩組兒童YTHDF2_1基因不同位點DNA甲基化水平比較[M(IQR)]

2.3 YTHDF基因DNA甲基化與乙肝疫苗免疫應答水平關系Logistic回歸分析 見表6。以免疫應答水平為因變量(低/無免疫應答水平=1，正常/高免疫應答水平=0)，以YTHDF1_1、YTHDF1_2以及YTHDF2_1基因的81個CpG位點甲基化水平為自變量，采用多因素非條件Logistic回歸模型評估兒童乙肝疫苗免疫應答水平和YTHDF基因甲基化水平間的關系。結果發現，YTHDF1_1基因23位點和YTHDF1_2基因140位點甲基化水平可能是乙肝疫苗低/無免疫應答的危險因素，而YTHDF1_2基因69位點和YTHDF2_1基因28位點甲基化水平可能是乙肝疫苗低/無免疫應答的保護因素(均P<0.05)。

表6 YTHDF基因DNA甲基化與乙肝疫苗免疫應答水平關系Logistic回歸分析

3 討 論

HBV感染導致的乙肝給我國公共衛生帶來嚴峻挑戰，接種乙肝疫苗可降低HBV感染風險，是目前安全有效的預防措施。我國經過30多年的免疫接種計劃，HBV感染得到了有效控制。我國普通人群HBsAg陽性率呈現明顯下降趨勢[3]，但仍有5%～10%的人群在接種乙肝疫苗后發生低/無免疫應答現象[4]。

HBV感染可通過影響體內T細胞亞群和免疫球蛋白水平導致機體細胞和體液免疫功能紊亂[13]。研究[14-15]表明，我國肝癌發病情況與CHB密切關聯，后者可通過多種機制(如表觀遺傳改變)促進肝細胞癌的發生。在表觀遺傳學研究中，強調DNA甲基化可以在不改變基因序列的情況下改變遺傳表現，控制基因的表達[16]。研究[17-19]發現，在CHB患者肝組織中可存在甲基化修飾，病毒基因組CpG島甲基化可能抑制病毒復制和病毒蛋白表達，宿主基因甲基化水平也影響著HBV復制、相關調控因子表達和肝臟炎癥發生過程。黨珊等[20]研究表明，HBV感染可上調Foxp3 mRNA表達，可能是機體調節過度免疫反應，從而增加了患原發性肝癌的風險。可見，宿主基因DNA甲基化在CHB、肝癌等肝類疾病中發揮著重要的作用，但未見DNA甲基化與乙肝疫苗低/無免疫應答的相關報道。

m6A甲基化修飾是真核生物mRNA的一種轉錄后修飾。YTHDF基因屬于m6A結合蛋白YTH同源結構域蛋白家族，具有能夠識別發生m6A修飾的堿基[8]。研究[9-11]表明，YTHDF可促進原發性肝癌和炎癥的發生與發展，但宿主YTHDF基因DNA甲基化水平是否會影響RNA的轉錄調控和蛋白表達，從而影響m6A修飾，導致免疫分子表達異常和乙肝疫苗低/無免疫應答的發生，目前未見相關報道。基于以上觀點，我們猜測YTHDF基因DNA甲基化水平可能會影響乙肝疫苗低/無免疫應答的發生。

本研究采用非匹配病例對照方法，對263例8～9月齡廣西壯族自治區漢族兒童進行DNA甲基化水平檢測，結果顯示YTHDF基因各基因位點甲基化水平都比較低；病例組和對照組甲基化水平在YTHDF1_1基因23位點、YTHDF1_2基因69位點與140位點的差異具有統計學意義；病例組YTHDF1_1基因23位點、YTHDF1_2基因69位點與140位點甲基化水平均高于對照組。這提示人體中YTHDF基因存在發生甲基化的可能，乙肝疫苗接種者低/無免疫應答水平可能受YTHDF1_1基因23位點、YTHDF1_2基因69位點與140位點的影響。非條件Logistic回歸分析顯示，YTHDF1_1基因23位點和YTHDF1_2基因140位點甲基化水平可能是乙肝疫苗低/無免疫應答的危險因素，可能增加了乙肝疫苗低/無免疫應答的風險；YTHDF1_2基因69位點和YTHDF2_1基因28位點甲基化水平可能是乙肝疫苗低/無免疫應答的保護因素，可能降低了乙肝疫苗低/無免疫應答的風險。因宿主基因組DNA甲基化涉及HBV持續感染相關疾病的發生，我們推測YTHDF作為m6A RNA甲基化酶，通過DNA甲基化修飾后可能使酶結構發生改變，相應功能也隨之發生改變，導致m6A RNA甲基化修飾出現異常，影響RNA轉移、穩定、翻譯、降解等過程，從而影響蛋白質合成，可能使宿主免疫調節分子的基因表達發生改變，引起乙肝疫苗接種者低/無免疫應答的發生。

綜上所述，YTHDF1_1基因23位點和YTHDF1_2基因140位點甲基化水平可能是乙肝疫苗低/無免疫應答的危險因素，YTHDF1_2基因69位點和YTHDF2_1基因28位點甲基化水平可能是乙肝疫苗低/無免疫應答的保護因素。但本研究樣本量較小，研究范圍僅限于三所醫院，僅基于YTHDF基因進行研究，研究對象資料收集得不夠全面，也未分析其他影響因素(包括非遺傳因素)對DNA甲基化水平與乙肝疫苗低/無免疫應答水平的相互影響，可能存在一定的選擇偏倚和混雜偏倚。在后續研究中，我們將針對上述問題進行改進，深入探討影響乙肝疫苗低/無免疫應答水平與哪些宿主基因及位點有關，從中篩選出更有價值的基因與位點作為乙肝疫苗低/無免疫應答水平的標志物，從而預測個體乙肝疫苗的免疫應答水平。