一種國產全自動微生物質譜檢測系統性能評價

李世榮，田月如，王鈺婷，林怡箐，關 明，蔣浩琴

復旦大學附屬華山醫院檢驗科，上海 200040

傳統對病原菌鑒定的方法需要觀察細菌在各種培養基中的菌落形態、顏色、氣味、是否溶血等，還需借助革蘭染色、氧化酶和觸酶等一系列生化反應，不僅操作煩瑣，所需時間較長，而且靈敏度和特異度較低，致使臨床治療方案難以及時制訂而極大地影響了患者的生存率和病死率[1]。近些年發展的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是一項包括微生物在內眾多物質的快速鑒定新技術，除了能對不同細菌的種、屬準確的鑒定外，還具有快速、方便和成本較低的優勢[2]，甚至一度被認為是可替代基因測序的方法[3]。MALDI-TOF MS的原理是將標本和基質混合涂抹于金屬靶板上，形成的共結晶薄膜，經激光照射后，標本分子獲得能量解吸附，基質和標本之間發生了電荷的轉移,標本分子獲得了質子并成為離子，后者在電場中飛速運動、聚焦，并進入飛行時間探測器。由于離子質荷比與飛行時長的平方比為常數，不同質荷比的離子具有不同的飛行時長，因此可依據獲得的質譜圖與圖譜庫進行對比，從而對不同的物質進行鑒別[4]。CMI-3800 MS是國內研發的一款質譜鑒定系統，對細菌鑒定性能目前還缺乏相應的數據評估。本文旨在通過利用該檢測系統對臨床常見302株非重復病原菌進行鑒定，客觀評估其對臨床病原菌鑒定結果的準確性。

1 資料與方法

1.1菌株來源 收集本院2021年3-5月來自臨床不同標本(血液、腦脊液、腹腔積液、 尿液、膿液、傷口分泌物和痰等) 分離的常見非重復菌株共302株，其中革蘭陽性菌88株，包括葡萄球菌35株，腸球菌21株，鏈球菌24株，其他8株；革蘭陰性菌157株，包括腸桿菌86株，非發酵菌45株，其他26株；念珠菌57株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，購自上海市臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑 CMI-3800 MS及配套試劑、菌種數據庫均購自廣州禾信康源醫療科技有限公司； VITEK 2 Compact鑒定儀；GP革蘭陽性菌鑒定卡、GN革蘭陰性菌鑒定卡、YST念珠菌鑒定卡、NH苛氧菌鑒定卡、ANC厭氧菌棒狀桿菌鑒定卡購自法國生物梅里埃公司；沙保弱培養基和血培養瓊脂平板均購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司； 35 ℃ CO2孵箱購自美國賽默飛世爾科技公司；厭氧發生袋購自OXOID公司。

1.3方法

1.3.1病原菌培養 將收集的菌株從-70 ℃低溫冰箱中取出，用1 μL一次性接種環以四區劃線的方式接種于血瓊脂平板。革蘭陽性或陰性需氧菌和兼性厭氧菌、念珠菌采用35 ℃ CO2孵箱培養18～24 h，難以生長的細菌可延遲至2～3 d；厭氧菌放入厭氧發生袋中密封后放入35 ℃ CO2孵箱培養中培養2～3 d，得到菌落后，為保證菌落必須為純菌落，再純分一次，以相同條件培養。

1.3.2VITEK 2 Compac鑒定儀鑒定 根據純菌落形態、革蘭染色結果以及簡單的生化實驗結果選擇相對應的細菌鑒定卡上機鑒定。革蘭陽性需氧菌采用GP細菌鑒定卡、革蘭陰性需氧菌采用GN細菌鑒定卡、念珠菌采用YST細菌鑒定卡、奈瑟菌等苛氧菌采用NH細菌鑒定卡、厭氧菌和棒狀桿菌采用ANC細菌鑒定卡。使用前將卡片和0.45%氯化鈉(NaCl)溶液從4 ℃冰箱取出，放室溫15～20 min，充分復溫。每根試管中加入3 mL 0.45% NaCl溶液配制菌懸液，并用比濁儀測定菌液濃度。將革蘭陽性或陰性需氧菌配制成0.50～0.63 McF的菌懸液濃度，念珠菌配制成1.8～2.2 McF的菌懸液濃度，奈瑟菌等苛氧菌、厭氧菌、棒狀桿菌配制成2.7～3.3 McF的菌懸液濃度。將配制好的菌懸液依次放在載卡架上，按照操作說明完成上機鑒定。

1.3.3CMI-3800 MS鑒定 35 ℃ CO2孵箱培養18～24 h得到純菌落后，用1 μL一次性接種環將校準菌株大腸埃希菌ATCC25922均勻涂在靶板的校準點位上，將待測純菌落均勻涂在測試點位上，涂菌后添加1 μL甲酸溶液(FA)，干燥后加1 μL α-腈基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質液，再次干燥后將樣品靶放入靶板槽中蓋好換樣蓋板，進靶，設置標準標本和盲樣，開始鑒定。病原菌的納入標準： CMI-3800 MS鑒定到種的得分>8.00分，鑒定屬的得分>6.00分；VITEK 2 Compact鑒定置信度≥89.00%。

1.3.4鑒定結果不一致標本處理 對于兩種方法鑒定不一致的菌株，重新接種平板復測確認，確認不一致的菌株送上海邁浦生物科技有限公司進行16SrDNA測序。擴增長度為1 500 bp，擴增區域為16S的全長序列。細菌16S PCR的引物為：27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG；1492R：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T。測序完成后，在NCBI數據庫里比對，得到菌株的最終鑒定結果。

1.4統計學處理 采用Excel進行數據處理，計數資料采用例數或百分率表示。

2 結 果

2.1CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact對286株菌的鑒定 對302例菌株標本進行分析，CMI-3800 MS鑒定到屬水平有297株，占98.34%，鑒定到種水平有288株，占95.36%；VITEK 2 Compact鑒定到屬水平有296株，占98.01%，鑒定到種水平有277株，占91.72%。兩種儀器檢測到屬水平一致的為296株，占98.01%，種水平一致的為277株，占91.72%； 6株鑒定結果屬不一致，占1.99%，25株鑒定結果種不一致，占8.28%。

2.2CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact對革蘭陽性和陰性菌的鑒定 表1與表2分別為革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的詳情。如表1所示，在88株革蘭陽性菌中，CMI-3800 MS鑒定到屬的為88株(100.00%)，鑒定到種的為84株(95.45%)。

表1 革蘭陽性菌株(n=88)

表2 革蘭陰性菌株(n=157)

VITEK 2 Compact鑒定到屬的為86株(97.73%)，鑒定到種的為79株(89.77%)。兩種方法在屬水平一致性為97.73%，在種水平一致性為89.77%。

在157株革蘭陰性菌中，CMI-3800 MS鑒定到屬的為154株(98.09%)，鑒定到種的為148株(94.27%)；VITEK 2 Compact鑒定到屬的為153株(97.45%)，鑒定到種的為142株(90.45%)。兩種方法在屬水平上一致性為96.82%，在種水平上一致性為90.45%。見表3。

表3 CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact對革蘭陽性和陰性菌株的鑒定(%)

2.3念珠菌鑒定結果 57株念珠菌，CMI-3800 MS可將57 株(100.00%)鑒定到屬，57株(100.00%)鑒定到種；VITEK 2 Compact可將57株(100.00%)鑒定到屬，56株(98.25%)鑒定到種，兩種方法在種的一致性為98.25%，在屬的一致性為100.00%。見表4。

表4 念珠菌菌株明細(n=57)

2.416SrDNA 基因測序 25株種不一致的標本中(其中包括屬不一致6株)，有7株細菌蛋白質指紋圖譜相似，屬于質譜方法學難以區分菌株，故對其余18株屬或種不一致的菌株進行16SrDNA 基因測序鑒定。18株標本的16SrDNA 基因測序鑒定結果中有12例標本與CMI-3800 MS鑒定的種水平完全一致，4株樣本屬水平一致，其余2例種屬均不一致； 16SrDNA 基因測序鑒定結果與VITEK 2 Compact鑒定結果相比較，13株屬一致，4株種屬均不一致，有1例VITEK 2 Compact鑒定儀未鑒定出來，見表5、6。

表5 7株質譜方法學難以區分菌株

表6 18株菌3種方法鑒定結果比較

3 討 論

MALDI-TOF MS技術已被證實在耐藥性分析和感染控制方面具有廣闊的應用前景[5]，不僅可實現快速的耐藥分析，而且可精確地對傳染疾病的病原菌進行診斷[6]。最近周淑燕等[7]用法國生物梅里埃MALDI-TOF-MS和VITEK 2 Compact對300 株臨床分離的病原菌進行了鑒定，法國生物梅里埃MALDI-TOF-MS鑒定到種水平的菌株有268 株(89.33%)，屬水平的菌株有297 株(99.00%)；VITEK 2 Compact鑒定到種水平有266 株(88.67%)； 屬水平的菌株有297 株(99.00%)。本研究用CMI-3800 MS與VITEK 2 Compact對302株菌株進行了分析，CMI-3800 MS鑒定到屬水平有297株(98.34%)，鑒定到種水平有288株(95.36%)；VITEK 2 Compact鑒定到屬水平有296株(98.01%)，鑒定到種水平有277株(91.72%)。比較MALDI-TOF MS系統檢測能力，CMI-3800 MS檢測屬水平(98.34%)與法國生物梅里埃MALDI-TOF MS(99.00%)相仿，但前者檢測種水平(95.36%)明顯高于后者(88.67%)。另外，周淑燕等[7]用兩種方法鑒定的種屬一致性分別為82.67%與98.33%。由此可見，CMI-3800 MS對細菌檢測能力和梅里埃MALDI-TOF-MS相當。另外，本研究兩種方法檢測種不一致的25株(其中包括屬不一致6株)中，由于有7株細菌的蛋白質指紋圖譜十分相似而難以用質譜方法學區分，為此本文用16SrDNA 基因測序對18株屬或種不一致的菌株進行了鑒定。結果表明，16SrDNA 基因測序確認與CMI-3800 MS鑒定種、屬水平一致的分別為12株(66.67%)和16株(88.89%)； 16SrDNA 基因測序與VITEK 2 Compact鑒定細菌為屬一致的有13株(72.22%)，4株種、屬均不一致，有1例菌株為惰性乳桿菌，其生長速度緩慢，故VITEK 2 Compact未能鑒定出結果。顯然，對少見菌鑒定的成功率和準確程度，CMI-3800 MS無疑比VITEK 2 Compact更勝一籌，更符合臨床對菌株樣本檢測的需求。

革蘭陽性菌和革蘭陰性菌為臨床常見的細菌。王冰等[8]用Biotyper MS和 Vitek-MS對63株革蘭陽性菌和83株革蘭陰性菌進行了鑒定，結果顯示兩種MS系統對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的種屬鑒定率均達95.00%，表明MALDI-TOF MS質譜檢測系統可對它們的種屬進行有效的鑒定。在本研究收集的302株菌株中，81.13%(245/302)的菌株為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。CMI-3800 MS對革蘭陽性菌種屬的鑒定率分別為95.45%(84/88)和100.00%(88/88)，對革蘭陰性菌種屬的鑒定率分別為94.27%(148/157)和98.09%(154/157)；VITEK 2 Compact對革蘭陽性菌種屬的鑒定率分別為89.77%(79/88)和97.73%(86/88)，對革蘭陰性菌種屬的鑒定率分別為90.45%(142/157)和97.45%(153/157)。顯然CMI-3800 MS對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌鑒定種的能力均高于VITEK 2 Compact。 然而，CMI-3800 MS對革蘭陰性菌中包括大腸埃希菌與志賀菌屬、沙門菌群、陰溝桿菌復合群、不動桿菌復合群等未能很好鑒定，除了可能與這些革蘭陰性細菌蛋白質指紋圖譜相似而難以區分外，亦與MALDI-TOF MS數據庫中缺乏某些菌屬如志賀菌屬[9]的數據有關，因此,在對沙門志賀菌進行鑒定時，一定要輔以血清學試驗結果作為最終的鑒定結果[10]。此外，在本研究中有1株人金黃桿菌和1株金色金色微菌也未能被CMI-3800 MS檢測系統鑒定，其原因可能是數據庫里菌株數量過少而無法達到質譜檢測靈敏度的要求，或是細菌數據庫里未儲存該菌種。

分析CMI-3800 MS對革蘭陽性菌中不同菌屬的鑒定能力，對腸球菌屬和葡萄球菌屬的種屬鑒定率均為100.00%，對鏈球菌的種屬鑒定率則分別為83.33%(20/24)和100.00%(24/24)，表明CMI-3800 MS對鏈球菌種的鑒定能力相對較弱，這與木尼熱·馬合蘇提等[11]用VITEK-MS對鏈球菌種的鑒定率(84.80%)十分接近，該文作者認為MS對鏈球菌種的鑒定率之所以比較低的原因可能是與鏈球菌之間的親緣關系比較相近或蛋白指紋圖譜峰的特征不明顯有關，陸丹等[12]建議，在鏈球菌的鑒定中，應根據實際情況結合其他輔助方法做出正確判斷，如進行奧普托欣敏感試驗。

王琦琦等[13]研究表明，MALDI-TOF MS可準確鑒定98.30%的念珠菌，對常見念珠菌鑒定的準確率為100.00%，而對少見念珠菌的鑒定準確率為95.70%。本研究CMI-3800 MS對57株念珠菌種屬鑒定率均為100.00%；而VITEK 2 Compact對它們屬的鑒定率為100.00%(57株)，種的鑒定率為98.25%(56株)。盡管耳念珠菌與希木龍念珠菌有較近的親緣關系[13]，但研究表明MALDI-TOF MS仍能夠準確地區分這兩種念珠菌[14-16]，并且MURO等[17]研究還認為，MALDI-TOF MS對希木龍念珠菌的鑒定比VITEK 2 Compact鑒定儀更為精準。在本研究中VITEK 2 Compact鑒定儀就是將1株希木龍念珠菌鑒定為耳念珠菌，而CMI-3800 MS則準確地把這1株念珠菌區分了出來。

綜上所述，CMI-3800 MS具有對臨床菌株檢測準確率高、通量大、重復性好、操作簡單和菌種數據庫完善等優勢，鑒定每株細菌的耗材成本較低，每日可鑒定微生物高達3 500株，可以滿足臨床實驗室對微生物鑒定的需求。