新生兒溶血病產前診斷的研究現狀和進展

劉榕孜 綜述，劉 峰 審校

廣西醫科大學第一附屬醫院輸血科，廣西南寧 530021

胎兒及新生兒溶血病(HDFN)是指因母嬰血型不合，母體天然存在或經輸血、妊娠等后天免疫刺激產生的針對胎兒紅細胞血型抗原的抗體，經胎盤進入胎兒血液循環，導致胎兒或新生兒同種免疫性溶血[1-2]，輕者可出現貧血、水腫、肝脾腫大，重者可能導致胎兒早期流產、胎兒發育停止和死亡，出生后的新生兒亦可以出現嚴重的核黃疸甚至死亡[1]。考慮到HDFN的發病會貫穿整個妊娠過程，因此，如何盡早且精準地篩查出具有高風險的HDFN妊娠事件，實施科學有效的妊娠監管以保護胎兒順利生長發育，實現優生優育，仍是當前該領域研究的主流和熱點。

1 HDFN的分類

臨床上依據致病性血型抗體的不同，通常可分為ABO-HDFN和非ABO-HDFN：(1)ABO-HDFN 多發生于血型為O型的母親，因其體內天然存在IgG抗A及抗B，而胎兒遺傳了父系的A或B基因后可表達出相應的A或B型抗原，母體IgG抗A和/或抗B透過胎盤后攻擊表達A/B抗原的胎兒紅細胞以及組織細胞，導致ABO-HDFN發病。目前國內以ABO血型不合引起的HDFN多見。ABO-HDFN在母親首次懷孕即可發生。(2)非ABO-HDFN 除了輸血導致孕婦產生相應的非抗A/B即意外抗體產生外，孕婦在妊娠期會出現胎兒母體出血(FMH)現象，胎兒紅細胞可進入母體血液循環后，引發母體非ABO血型抗原同種免疫，產生相應的意外抗體，最常見于抗Rh抗體[3]，臨床上非ABO-HDFN以Rh-HDFN常見。Rh陰性女性首次懷孕Rh陽性胎兒時，通常產生IgM抗體，不能穿過胎盤導致胎兒溶血；而再次懷孕Rh陽性胎兒時，母體則會迅速產生IgG 抗體，其能有效穿過胎盤導致胎兒溶血反應[3]。MNS、Kell、Kidd及 Duffy等其他血型系統不合亦可引起HDFN[4-5]。

2 紅細胞同種抗體特異性與HDFN發病風險、嚴重程度的相關性

發生HDFN的風險取決于幾個因素：紅細胞同種異體抗體的特異性、所涉及的血型抗原在胎兒紅細胞的表達水平等[2]。ABO血型系統中，抗A/B抗體是臨床上常見導致HDFN發病的原因，疾病多為輕度[6]。Rh血型系統中，抗D/C/c/E/e/G/CW/hrS/hrB/Ew/Goa/Rh32/Bea/Evans/Tark等抗體與HDFN發病相關，嚴重者可導致胎兒死亡[6-7]。MNS血型系統中，抗M/S/s/U/Ena/Mia/Mur/Vw抗體與HDFN發病相關，其中抗M/Mia/Mur/Vw抗體可導致嚴重HDFN[6]。P1PK血型系統HDFN發病風險低，但抗PP1PK抗體(特別是抗P成分)與早期自然流產有關[6-8]。Kell血型系統中，所有的抗Kell抗體都可能導致HDFN，如抗K/k/Kpa/Kpb/Jsa/Jsb/Ula/KEL5/KEL11/KEL18/KEL22/KEL28抗體等，同時該抗體可通過抑制胎兒紅細胞生成導致胎兒貧血[6]。Duffy血型系統中，抗Fya/Fyb抗體與HDFN發病相關[6]。Kidd血型系統中，抗Jka/Jkb抗體與HDFN發病相關[6]。Diego血型系統中，抗Dia/Dib/Wra/ELO抗體與HDFN發病相關，其中抗Dia/Wra/ELO抗體可導致嚴重HDFN[6]。JR血型系統中，抗Jra抗體與嚴重的HDFN有關[9]。LAN血型系統中，抗LAN抗體多導致輕度HDFN[11]。國際輸血學會(ISBT) 200系列，抗i抗體可引起輕度HDFN，其機制是母體自身抗i抗體可穿過胎盤，從而導致新生兒輕度黃疸[10]。ISBT 700系列，抗Bi/Rea/Lia/Kg/JONES/HJK/HOFM/REIT抗體與HDFN發病相關[10]。ISBT 901系列，抗MAM抗體與HDFN發病相關[10]。考慮到眾多的致病性血型抗體均可導致HDFN，臨床上如何提高抗體檢出率和準確性，對于明確HDFN的診斷及后續的治療至關重要。

3 妊娠期紅細胞同種抗體的診斷策略

3.1ABO-HDFN的診斷策略 當前常規的試驗診斷策略是依據孕婦及配偶ABO血型組合及相應妊娠期IgG抗A/B的效價測定。IgG抗A/B是衡量ABO-HDFN發病風險高低的重要因素，但其是否能成為致病性抗體，必須要以真實存在母嬰血型不合即胎兒及新生兒上表達對應陽性ABO抗原作為發病基礎。2021年國內專家共識針對ABO-HDFN產前監測仍以親代血型表型不合結合IgG抗A/B的效價為主要臨床風險預測的技術手段[1]。

3.2非ABO-HDFN的診斷策略 國內有研究報道關于抗D效價與HDFN發病率的統計分析結果顯示：IgG抗D效價<16，發病率5.40%(低風險)；16≤IgG抗D效價<32，發病率33.33%(中等風險)；32≤IgG抗D效價<64，發病率81.81%(高風險)；64≤IgG抗D效價<128，發病率92.11%(高風險)；128≤IgG抗D效價<256，發病率95.65%(高風險)；IgG抗D效價≥256，發病率100.00%(高風險)[11]。值得說明的是，部分臨床醫生在妊娠管理時比對過孕婦及配偶雙方血型結果后會直接開具檢測某一稀有血型抗體效價測定，這其實是不嚴謹的，科學的診斷策略是首先通過意外抗體篩查和鑒定試驗明確診斷出血型抗體類型后后方能對其進行效價的測定。因此，血型意外抗體的實際檢出率成為制約致病性抗體診斷及非ABO-HDFN診斷的重要因素。一方面，當前國內外大多數實驗室采用8～16人份不等的商品化的抗體鑒定譜細胞，然而不同廠家的譜細胞覆蓋血型抗原的種類和純雜合子特征差異非常大，同時復雜的抗體鑒定過程中通常還需要聯合復雜的血型血清學技術，甚至血型基因分型才能做到精準的抗體鑒定，因此對鑒定人員的理論知識和技術水平要求非常高。另一方面，許多稀有血型表型診斷的抗體試劑因為價格昂貴、極難甚至無法獲得商品化的試劑，因此，很多文獻報道的非ABO-HDFN的血型診斷都需要對孕婦、配偶和新生兒進行基因分型鑒定，這也導致這些非ABO-HDFN在常規和基層醫院的實驗室無法開展，客觀上也弱化了基層醫療機構對非ABO-HDFN的認識、有效妊娠管理和精確診斷。

4 妊娠期無創產前診斷技術研究進展

針對高危孕婦，早期的產前診斷為有創診斷，即通過羊膜腔穿刺術、絨毛膜絨毛穿刺術和經陰道灌洗術等獲取到胎兒標本進行血型基因分型。羊膜腔穿刺術可導致自發性流產和羊水滲漏[14]。侵入性操作都會增加FMH的風險，導致同種免疫發生并產生抗體[15]。因此，非侵入性檢測技術成為目前研究熱點。

4.1胎兒游離DNA(cff-DNA)

4.1.1cff-DNA在預測胎兒血型中的運用 妊娠期母體血漿中可檢測到cff-DNA，cff-DNA來源于滋養細胞，滋養細胞通過胎盤轉移，發生凋亡，釋放DNA進入母體[16]。cff-DNA在妊娠早期占母體血漿DNA水平約為3.40%，在孕晚期約占6.20%[17]。目前胎兒基因分型技術已廣泛應用于胎兒ABO、Rh血型篩查、性別連鎖疾病和染色體非整倍體診斷等[18]。我國已有使用cff-DNA技術報道，馬紅麗等[19]報道利用PCR-RFLP技術建立從O型孕婦外周血中提取DNA檢測胎兒血型的實驗方法，39例新生兒出生前后血型檢測符合率為94.24%，孕中期血型檢測符合率為91.95%，孕晚期的血型檢測符合率為98.00%。于洋等[20]使用從孕婦外周血中分離胎兒ABO血型基因DNA，運用PCR-SSP技術進行胎兒血型基因型鑒定，預測胎兒的ABO血型表型，符合率為100.00%。馬玲等[21]使用用Y染色體相關基因(SRY)及甲基化表觀遺傳標志RASSF1A作為胎兒DNA內參基因，運用PCR-SSP及實時熒光PCR技術在O型孕婦外周血漿中檢測胎兒ABO基因型，其預測胎兒血型與胎兒出生后ABO血型表型一致。對于存在抗D的RhD陰性母親，采用RhD雜合子檢測和cff-DNA技術檢測胎兒RhD基因型，對高風險的Rh血型不合的HDFN進行早期干預，如注射抗-D免疫球蛋白[22]。

4.1.2運用血型基因檢測技術應注意的問題 目前確認了43個血型系統，抗原數345個，繼PCR檢測血型技術以來，二代測序成為新型檢測手段，具有高通量、自動化的顯著特征，但二代測序存在假陽性的問題。由于血型抗原基因多態性，基因檢測技術仍面臨特異性引物設計困難。如MNS血型系統糖蛋白A、B和E(分別為GPA、GPB和GPE)的基因包含跨越前四個外顯子9～15的高度同源區域[23]。外顯子堿基互換、內含子堿基互換、單堿基突變、不同血型糖蛋白基因在序列各個部分之間的交換等都可導致新抗原的出現。同時，基因重排可能會影響引物序列，使引物不表達，導致假陰性。胎兒遺傳的部分D或弱D表型可導致RhD假陰性[17]，RhD陰性男性胎兒的Y染色體基因序列(SRY、DBY和TTTY2)、短串聯重復序列和低甲基化啟動子序列等內參基因可有效地用作胎兒內部標記[17]。有觀點認為，基于RT-PCR的胎兒RhD檢測分析應重復多次，至少兩個RhD特異性外顯子引物(最常見的外顯子5、7和/或10)進行3次重復，可提高檢測的準確性[17]。另一方面，cff-DNA在母體循環中數量低，且標本采集、運輸、儲存和處理過程中，母體血細胞裂解、釋放的DNA不斷增加，使循環中胎兒DNA被稀釋。血漿DNA酶降解胎兒DNA，使胎兒血漿DNA高度碎片化。另外，標本中大量的母體DNA使胎兒DNA分析更加困難。低水平的cff-DNA可導致RhD假陰性[17]，因此，取樣后6 h內處理標本，可有效提高檢出效率。

4.1.3血型表型與基因型可能存在的差異 HDFN發病前提是以表型的抗原抗體為基礎。ABO血型與H血型有密切關系，孟買血型是H基因突變的結果，因其上位效應影響ABO基因產物，造成了ABO血型異常表現[24]。因此，進行ABO血型基因分型時，應加做H基因檢測以提高表型預測的準確率。RhAG 蛋白雖然自身不產生抗原，但是它可以輔助RhD及RhCE 蛋白錨定在紅細胞膜上，形成Rh蛋白復合體，并且參與RhD抗原的缺失和表達[25]。因此，在進行RhD/RhCE基因檢測時，也要進行RhAG基因檢測。

4.2大腦中動脈收縮期峰值流速(MCA-PSV) 其他非侵入性診斷技術如胎兒MCA-PSV，通過MCA-PSV測量更準確評估胎兒貧血。2021年專家共識提出[1]：IgG抗體效價明顯升高時，采用多普勒超聲技術進行胎兒MCA-PSV測定，根據胎兒貧血的病理生理改變，包括胎兒形態學及血流動力學變化有效監測胎兒貧血程度，當MCA-PSV>1.5 MoM(中位數)時，即需要進行臨床干預。

5 小 結

綜上所述，HDFN是一種多層面疾病，不能簡單依賴抗體為主的當前診斷策略，一方面需要提高致病性抗體鑒定的技術條件和水平，另一方面還是需要擴大孕婦及配偶的血型鑒定，尤其是當稀有血型表型診斷存在困難時，可以充分利用血型基因分型技術進行產前診斷，對于存在高風險的孕婦則可以利用母體血漿cff-DNA實現早期診斷母嬰血型不合是否存在及類型，同時動態評估致病性抗體的效價及危害程度，才能在真實意義上實現血型不合HDFN的早期診斷和精準的妊娠管理。