FOXP3、MUC5AC在支氣管炎患兒中的表達及與Th9細胞因子的相關性研究

段巧玲,張洪巖,趙 悅,孫亞娟,李 瑩,成佳文,周興棉△,崔功顥,曹晨瑋

河北中醫學院第二附屬醫院：1.兒科；2.檢驗科，河北定州 073000

支氣管炎是嬰幼兒常見的下呼吸道感染性疾病，最常見病因為病毒感染，主要為呼吸道合胞病毒(RSV)，是世界范圍內嬰幼兒住院的最常見原因，也是兒童發生哮喘的主要獨立危險因素[1]。免疫功能失調是小兒支氣管炎發病的重要機制[2]。近年來研究發現，輔助性T細胞9(Th9)細胞作為一種新型Th細胞亞群，其主要免疫學機制是活化炎癥細胞，分泌趨化及炎性因子，導致炎性損傷[3]。已有研究報道，支氣管炎患兒急性期外周血中Th9細胞因子表達明顯升高[4]。叉狀頭/翼狀螺旋轉錄因子(FOXP3)是叉狀頭/翼狀螺旋轉錄調節因子家族成員，可作為CD25+T細胞的特異性標志，與機體免疫調節功能密切相關[5]。氣道黏液高分泌是小兒支氣管炎的病理生理特征，而黏蛋白是維持黏液黏彈性的主要成分[6]。黏蛋白5AC(MUC5AC)是氣道黏液中最為重要的黏蛋白，常作為衡量氣道上皮黏液分泌的指標[7]。目前，關于FOXP3、MUC5AC在支氣管炎患兒中表達的研究較少，且FOXP3、MUC5AC表達與Th9細胞因子關系及是否與哮喘發生有關聯，也少見報道。基于此，本研究對此展開探討，旨在為小兒支氣管炎發病機制完善、臨床治療及哮喘早期防治提供依據?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年2月至2021年2月本院收治的支氣管炎患兒94例作為觀察組，選取同期健康體檢兒童45例作為對照組。觀察組男56例，女38例；月齡2～19個月，平均(7.26±2.24)月；病程1～5 d,平均(2.71±0.75)d；體質：特應性體質41例，非特應性體質53例；病情嚴重程度：輕度30例，中度41例，重度23例；呼吸疾病史：有73例，無21例；食物過敏史：有12例，無82例；居住環境：城鎮52例，農村42例；父親吸煙54例；分娩方式：自然分娩59例，剖宮產35例；出生時母親年齡21～34歲，平均(27.16±2.61)歲。納入標準：觀察組均符合《諸福棠實用兒科學》[8]中支氣管炎診斷標準，入院前未接受任何免疫抑制劑或免疫增強劑治療；家屬均知情，并簽署承諾書。排除標準：呼吸道先天畸形；先天性心臟病、免疫缺陷病；合并哮喘等其他呼吸系統疾?。缓喜⒙韵男约膊　φ战M男26例，女19例；月齡2～21個月，平均(7.51±2.19)月；呼吸疾病史：有35例，無10例；食物過敏史：有6例，無39例；居住環境：城鎮24例，農村21例；父親吸煙26例；分娩方式：自然分娩28例，剖宮產17例；出生時母親年齡22～32歲，平均(26.98±2.33)歲。兩組年齡、性別、呼吸疾病史、食物過敏史、居住環境、父親吸煙情況、分娩方式、出生時母親年齡基礎資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 (1)FOXP3 mRNA檢測。采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定，治療前取外周靜脈血3 mL，采用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞(PBMC)，以Trizol提取總RNA，反轉錄合成cDNA，后進行PCR擴增，以β-actin為內參，FOXP3引物：上游(5′-3′)為CTG ACC AAG GCT TCA TCT GTG，下游(5′-3′)為ACT CTG GGA ATG TGC TGT ITC；β-actin：上游(5′-3′)為TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG，下游(5′-3′)為CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分析各條帶平均灰度值，結果以FOXP3/β-actin的Ct比值表示。(2)MUC5AC mRNA檢測。采用RT-PCR測定，治療前，晨起空腹2 h，3%高滲鹽水10 mL氧泵吸入10～15 min，霧化后拍背1～2 min，吸痰3～5 mL，以Trizol提取總RNA，反轉錄合成cDNA，后進行PCR擴增，以β-actin為內參，MUC5AC引物：上游(5′-3′)為TGC CAG GAG CTG CGG ACC TC，下游(5′-3′)為CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G；β-actin：上游(5′-3′)為TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG，下游(5′-3′)為CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分析各條帶平均灰度值，結果以MUC5AC/β-actin的Ct比值表示。(3)Th9細胞、白細胞介素-9(IL-9)：采用流式細胞學檢測PBMC中Th9細胞比例；另取外周靜脈血3 mL，3 500 r/min，半徑8 cm，離心9 min，取血清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-9，采用北京朗頓公司試劑盒。

1.3觀察指標 (1)觀察組與對照組FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例。(2)不同病情支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例。根據Bearman和Pierson[9]修訂的臨床評分標準，評分4～6分、7～9分、10～12分，分別為輕度、中度、重度。(3)支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9及Th9細胞比例與病情嚴重程度的相關性。(4)支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA與Th9細胞比例的相關性。(5)患兒治療后隨訪6個月，觀察患兒預后(是否有喘息發作)情況。支氣管炎患兒預后的影響因素。

2 結 果

2.1觀察組與對照組FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例比較 觀察組FOXP3 mRNA、IL-9水平低于對照組，MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 觀察組與對照組FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例比較

2.2不同病情嚴重程度支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例比較 不同病情支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；隨病情嚴重程度加重，FOXP3 mRNA逐漸降低，MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例逐漸升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同病情嚴重程度支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例比較

2.3支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、Th9細胞比例及IL-9與病情嚴重程度的相關性 Spearman相關性分析可知，支氣管炎患兒FOXP3 mRNA與病情嚴重程度呈負相關(r=-0.657，95%CI：-0.762～-0.520，P<0.001)，MUC5AC mRNA(r=0.842，95%CI：0.797～0.907，P<0.001)、Th9細胞比例(r=0.691，95%CI：0.564～0.786，P<0.001)、IL-9(r=0.750，95%CI：0.642～0.829，P<0.001)與病情嚴重程度均呈正相關。見圖1～4。

圖1 FOXP3 mRNA與病情嚴重程度相關性

圖2 MUC5AC mRNA與病情嚴重程度相關性

圖3 Th9細胞比例與病情嚴重程度相關性

圖4 IL-9與病情嚴重程度相關性

2.4支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA與Th9細胞比例及IL-9的相關性 Pearson相關性分析可知，支氣管炎患兒FOXP3 mRNA與Th9細胞比例(r=-0.834，95%CI：-0.855～-0.801，P<0.001)、IL-9(r=-0.831，95%CI：-0.854～-0.798，P<0.001)均呈負相關；MUC5AC mRNA與Th9細胞比例(r=0.837，95%CI：0.807～0.858，P<0.001)、IL-9(r=0.872，95%CI：0.858～0.881，P<0.001)均呈正相關。見圖5～8。

圖5 FOXP3 mRNA與Th9細胞比例相關性

圖6 FOXP3 mRNA與IL-9相關性

圖7 MUC5AC mRNA與Th9細胞比例相關性

圖8 MUC5AC mRNA與IL-9相關性

2.5支氣管炎患兒預后影響因素的單因素分析 94例支氣管炎患兒治療后隨訪6個月，21例發生喘息，發生率為22.34%(21/94)。體質、病情分度、FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、Th9細胞比例、IL-9均為支氣管炎患兒喘息發作的影響因素(P<0.05)，見表3。

2.6支氣管炎患兒預后影響因素的多因素分析 以支氣管炎患兒治療后6個月喘息發作情況為因變量(無喘息發作=0，喘息發作=1)，將表3中差異有統計學意義的因素作為自變量(體質：特應性體質=1，非特應性體質=2；病情程度：輕度=1，中度=2，重度=3；FOXP3 mRNA：低表達=1，高表達=2；FOXP3 mRNA：低表達=1，高表達=2；Th9細胞比例：低表達=1，高表達=2；IL-9：低表達=1，高表達=2)，應用Logistic回歸模型分析，結果顯示，將體質、病情程度控制后，FOXP3 mRNA低表達，FOXP3 mRNA、IL-9高表達及Th9細胞比例升高為喘息發作的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表3 支氣管炎患兒預后影響因素的單因素分析[n(%)]

表4 支氣管炎患兒預后影響因素的多因素分析

3 討 論

小兒支氣管炎特點是炎性因子和黏液分泌增加，導致呼吸急促、鼻炎、呼吸做功增加等一系列呼吸道癥狀，且與患兒后期復發性喘息和哮喘發病存在密切關系[10]。研究證實，Th細胞通過識別病毒抗原并觸發細胞、體液免疫，在小兒支氣管炎發病中發揮關鍵作用[11]。Th9細胞是近年來發現的一類CD4+T細胞亞群，其主要通過分泌IL-9參與自身免疫性疾病、支氣管哮喘等病理過程[12]。目前，Th9細胞及IL-9在小兒支氣管炎發病機制中的作用尚少見報道，本研究顯示，相較于健康體檢兒童，支氣管炎患兒Th9細胞比例、IL-9水平升高，且與病情嚴重程度呈正相關。Th9細胞由轉化生長因子和IL-4聯合刺激下分化而來，以大量分泌IL-9為特征，IL-9可促進T淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞增殖，增加IL-17、IL-8、轉化生長因子-β、組胺、血管內皮生長因子等因子釋放，促進氣道重塑，參與機體炎癥反應[13]。因此，Th9細胞可能通過上述機制參與了小兒支氣管炎的發生發展。

CD4+CD25+Treg是主要表達CD25分子的CD4+T細胞亞群，可強烈抑制Th2產生及Th2所誘導的嗜酸粒性細胞在氣道聚集，研究證實，支氣管炎患兒CD4+CD25+Treg表達下調[14]。FOXP3是CD4+CD25+調節性T細胞分化發育的關鍵基因[15]。研究顯示，FOXP3突變小鼠存在多器官炎癥應答反應，出現嗜酸性粒細胞增高、過敏性氣道炎癥、Thl/Th2型細胞因子失衡[16]。本研究通過RT-PCR檢測發現，支氣管炎患兒FOXP3 mRNA表達水平明顯低于健康體檢兒童，且與病情嚴重程度呈顯著負相關，同時，其表達水平與Th9細胞比例、IL-9存在依賴關系。說明支氣管炎患兒體內FOXP3 mRNA水平降低，可能引起Th9細胞比例、IL-9升高，造成免疫調節功能受損。FOXP3 mRNA低表達可引起外周血CD4+CD25+Treg細胞數量不足，免疫抑制功能降低，進而引起效應性CD4+T細胞尤其是Th2細胞大量增殖活化，Th9細胞比例及IL-9升高，產生大量致炎因子，促進支氣管炎患兒病情進展[17]。

黏蛋白是呼吸道黏液的主要成分，而MUC5AC作為氣道黏液中最為重要的黏蛋白，在肺部疾病中受到了廣泛關注[18]。MUC5AC產生調控有3條重要信號通路，叉頭轉錄因子A2(FoxA2)是MUC5AC表達抑制劑；IL-13誘發黏液化生和MUC5AC表達；表皮生長因子受體誘導MUC5AC表達[19]。支氣管炎患兒IL-13異常高表達，上調信號轉導與轉錄活化因子6磷酸化，并抑制FoxA2，進而促進MUC5AC表達，導致黏液高分泌。因此，MUC5AC參與小兒支氣管炎發生及病情發展。進一步分析發現，支氣管炎患兒MUC5AC mRNA與Th9細胞比例、IL-9呈正相關。研究表明，IL-9可能通過鈣激活氯離子通道調控黏蛋白表達，促進呼吸道上皮細胞分泌黏液，促使炎癥細胞在氣管、支氣管及肺部聚集，加重局部炎癥反應[20]。因此，推測MUC5AC與Th9細胞因子協同參與小兒支氣管炎病情進展。

嬰幼兒時期反復呼吸道感染，尤其是支氣管炎對嬰幼兒哮喘發病有很大影響。研究顯示，50%以上毛細支氣管炎患兒在2～3歲有復發性喘息，隨時間推移，喘息癥狀趨于好轉，但仍有15%～30%在學齡前期發生哮喘[21]。目前，臨床尚缺乏有效的客觀指標預測小兒支氣管炎的轉歸。本研究采用Logistic回歸模型分析顯示，將體質、病情程度控制后，FOXP3 mRNA低表達，FOXP3 mRNA、IL-9高表達、Th9細胞比例為喘息發作的獨立危險因素。RSV支氣管炎患兒易轉變為兒童哮喘，Th2源性細胞因子在其中發揮主要作用已得到公認[22]。IL-9是Th2細胞源性細胞因子，通過誘導嗜酸性粒細胞聚集、黏膜分泌黏液增加等參與過敏性慢性氣道炎癥反應，在哮喘發病過程中發揮重要作用[23]。支氣管炎患兒存在表達FOXP3 mRNA的調節性T細胞減少，該群調節性T細胞異?？赡苁侵夤苎籽葑優橄闹匾蛑籟24]。氣道黏液高分泌是哮喘的一個特征性病理生理改變，MUC5AC在哮喘中的作用已得到公認[25]。另外，FOXP3 mRNA、FOXP3 mRNA表達水平與Th9細胞比例、IL-9水平存在明顯相關性，可能協同參與喘息發作，但相關生物途徑需進一步研究加以證實。因此，早期測定FOXP3 mRNA、FOXP3 mRNA、IL-9水平及Th9細胞比例，預測喘息發作風險，可為哮喘早期防治提供依據。

支氣管炎患兒FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA與Th9細胞因子存在明顯相關性，各指標異常表達可能是免疫功能失調的機制之一，并增加治療后喘息發作風險。但FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA影響Th9細胞因子的具體通路仍有待進一步探討。