miR-383和PRDX3在結腸癌組織中的表達水平及意義

楊學麗，姜琳娜，安 欣，吳倩嵐，江現麗，魏 娉，李智峰

邯鄲市第一醫院：1.病理科；2.普外科，河北邯鄲 056002

結腸癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，手術切除輔以放化療是主要的治療方式，但術后易轉移復發，病死率高，嚴重危害人類的生命健康[1]。因此研究結腸癌的發生、發展機制，尋找可早期提示預后的分子標志物具有重要意義。微小RNA-383(miR-383)與多種腫瘤的發生、發展相關，研究表明，膠質瘤內皮細胞中miR-383表達明顯下調，miR-383過表達能顯著抑制內皮細胞的增殖、遷移，以及小管形成和球狀血管生成[2]。崔盈等[3]研究表明，miR-383在結腸癌組織中表達降低，上調miR-383表達對結腸癌細胞具有抑制增殖和降低侵襲及遷移能力的作用。硫氧還蛋白依賴的過氧化物還原酶3(PRDX3)為一類存在于細胞線粒體中的過氧化物酶，通過調節細胞內活性氧化物水平，參與細胞增殖、分化與凋亡，對腫瘤的發生、發展起著重要作用。丁妍等[4]研究表明，PRDX3在食管鱗狀細胞癌中表達水平升高，且與腫瘤的分期分級、淋巴結轉移呈正相關。然而，目前miR-383與PRDX3同時在結腸癌中的研究報道不多。本研究通過檢測miR-383與PRDX3在結腸癌組織中的表達情況，探討miR-383和PRDX3在結腸癌中的表達水平及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年5月至2018年6月在本院確診為結腸癌患者的結腸癌組織標本85份，其中男44例，女41例；年齡32～88歲，平均(58.50±12.60)歲；<60歲38例，≥60歲47例；腫瘤最大徑<50 mm者40例，≥50 mm者45例；腫瘤分化程度：低分化35例，中、高分化50例；TNM分期[5]：Ⅰ～Ⅱ期者37例，Ⅲ～Ⅳ期者48例；浸潤深度：T1/T2 39例，T3/T4 46例；有淋巴結轉移47例，無淋巴結轉移38例。納入標準：(1)符合結腸癌診斷標準[5]，且病理學檢查確診；(2)每份標本臨床、病理資料完整；(3)所有患者均為初次診斷，術前均未行任何抗腫瘤治療。排除標準：(1)合并嚴重心、肝、肺、腎功能不全；(2)合并其他系統的惡性腫瘤者；(3)臨床資料不全者。另選取同期88例行腸鏡檢查人員的正常結腸黏膜組織標本作為對照，其中男45例，女43例；年齡31～86歲，平均(57.97±12.27)歲。研究標本采集均經過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(批號76205)購自德國Qiagen公司；逆轉錄試劑盒(批號K5076)和聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(批號K7009)購自美國Thermo Fisher公司；免疫組織化學試劑盒(批號ab30556)、PRDX3鼠抗人單克隆抗體(批號ab70224)購自美國Abcam公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號LightCycler480)購自羅氏診斷產品(上海)有限公司；顯微鏡(型號DMI8)購自德國徠卡公司。

1.3研究方法

1.3.1標本采集及保存 采用RNA提取試劑盒從冰凍的結腸癌組織及正常結腸黏膜組織標本中提取總RNA，用DNA酶去除DNA，檢測RNA濃度與純度，反轉錄得到cDNA，置于-20 ℃保存備用。將另外一部分結腸癌組織及正常結腸黏膜組織標本做成石蠟切片，用于免疫組織化學染色。

1.3.2qRT-PCR檢測miR-383、PRDX3信使核糖核酸(mRNA)的表達水平 采用qRT-PCR檢測miR-383、PRDX3 mRNA的表達水平，miR-383、PRDX3 mRNA及內參基因U6、β-actin引物序列由上海吉瑪公司設計與合成，引物序列見表1。反應體系20 μL，反應條件：95 ℃，75 s；95 ℃，15 s；60 ℃，75 s；95 ℃，15 s；40個循環。每個樣品設置3個復孔。反應結束后，采用2-ΔΔCt分析法計算相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫組織化學染色 將石蠟切片后，經過脫蠟、抗原修復和去除內源性過氧化物酶活性后，加10%山羊血清封閉，PRDX3鼠抗人單克隆抗體(工作濃度1∶100)，于4 ℃過夜，DAB染色，蘇木精復染細胞核，封片，顯微鏡觀察。染色結果判斷：PRDX3抗體定位于細胞胞質或出現于細胞膜上，出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。陽性細胞數：<5%，記為0分；5%～<25%，染色淡黃色，記1分；25%～<50%，染色黃色，記2分；50%～75%，染色棕黃色，記3分；>75%，染色棕褐色，記4分；根據陽性細胞染色強度判定，細胞無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者積分的乘積作為評判標準[6]：得分0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，6和8分為陽性(++)，9分及以上為強陽性(+++)。統計時將弱陽性、陽性、強陽性計算為陽性結果。

1.4預后隨訪 術后對所有患者進行電話或門診隨訪，隨訪期限是3年，隨訪起始時間為術后第1天，隨訪截止日期為2021年6月30日，觀察患者生存情況，患者無失訪。

2 結 果

2.1結腸癌組織與正常結腸黏膜組織中miR-383及PRDX3 mRNA表達水平比較 與正常結腸黏膜組織比較，結腸癌組織中miR-383表達水平顯著降低，PRDX3 mRNA表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 結腸癌組織與正常結腸黏膜組織中miR-383及PRDX3 mRNA表達水平比較

2.2結腸癌組織與正常結腸黏膜組織中PRDX3蛋白陽性表達率比較 免疫組織化學染色結果顯示，PRDX3蛋白主要定位于細胞膜與細胞質，結腸癌組織中PRDX3蛋白陽性表達率顯著高于正常結腸黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表3。

表3 結腸癌組織與正常結腸黏膜組織中PRDX3蛋白陽性表達率比較

圖1 結腸癌組織與正常結腸黏膜組織中PRDX3表達(×200)

2.3結腸癌組織中miR-383和PRDX3 mRNA表達水平的相關性 結腸癌組織中miR-383表達水平和PRDX3 mRNA呈負相關(r=-0.616，P<0.001)，見圖2。通過TargetScanHuman軟件預測顯示，miR-383和PRDX3存在靶向結合位點，見圖3。

圖2 結腸癌組織中miR-383和PRDX3 mRNA關系的散點圖

圖3 miR-383和PRDX3靶向關系預測

2.4miR-383和PRDX3表達水平與結腸癌臨床病理特征的關系 以結腸癌組織中miR-383表達水平的平均值(0.67)為界，將結腸癌患者分為miR-383高表達組(≥0.67)42例和miR-383低表達組(<0.67)43例；以PRDX3蛋白免疫組織化學染色結果將結腸癌患者分為PRDX3高表達組(染色結果為++和+++)43例和PRDX3低表達組(染色結果為-和+)42例；分析發現，miR-383、PRDX3表達水平與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、浸潤深度無關(P>0.05)，與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表4。

表4 miR-383和PRDX3表達水平與結腸癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.5miR-383和PRDX3表達與結腸癌患者生存率的關系 隨訪3年，患者生存44例，死亡41例；通過Kaplan-Meier生存分析可知，miR-383高表達組結腸癌患者3年累積生存率28/42(66.67%)顯著高于miR-383低表達組16/43(37.21%)(χ2=5.903，P=0.015)；PRDX3高表達組結腸癌患者3年累積生存率17/43(39.53%)顯著低于PRDX3低表達組27/42(64.29%)(χ2=5.213，P=0.022)，見圖4。

圖4 Kaplan-Meier生存分析注：A為不同miRNA-383表達水平結腸癌患者生存曲線；B為不同PRDX3表達水平結腸癌患者生存曲線。

2.6結腸癌患者預后影響因素分析 Cox回歸模型單因素分析結果顯示，影響結腸癌患者不良預后危險因素為低分化、淋巴結轉移、miR-383低表達、PRDX3高表達(P<0.05)，而性別、年齡、腫瘤最大徑、TNM分期、浸潤深度與結腸癌患者預后無關(P>0.05)；多因素分析結果顯示，結腸癌低分化、淋巴結轉移、miR-383低表達、PRDX3高表達是結腸癌患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響結腸癌患者不良預后的危險因素分析

3 討 論

結腸癌是我國常見的惡性腫瘤，發病率呈逐年升高趨勢，尤以中老年人發病居多，是影響生命安全的主要惡性腫瘤之一[7]。研究結腸癌的發病機制，對尋找其有效治療手段和預后評估方法具有重要意義。miRNAs在細胞增殖、分化、生長、發育等多種過程中發揮重要作用，其表達異常與多種腫瘤發生發展有關[8-9]。研究表明，miR-383在多種腫瘤組織或細胞中表達下調，可影響腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[10-12]。WAN等[13]研究結果表明，miR-383通過干擾素調節因子1，參與調節膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。ZHU等[14]研究表明，miR-383在胃癌組織中表達顯著降低，且與胃癌患者的晚期進展相關，功能分析表明，miR-383過表達可抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡。研究結果顯示，miR-383在結腸癌組織與細胞中低表達，發揮抑癌基因的作用，上調miR-383表達可抑制結腸癌細胞的增殖、遷移與侵襲[15-16]。最新研究結果顯示，miR-383表達與結腸癌TNM分期和淋巴結轉移有關[17]。本研究結果顯示，在結腸癌組織中miR-383表達水平低于正常結腸黏膜組織，與以往報道結果類似[15-16]。本研究分析發現，miR-383表達與TNM分期及淋巴結轉移有關，與趙亮等[17]研究結果一致，本研究還發現，miR-383表達與結腸癌分化程度有關，提示miR-383可能與結腸癌發生、發展有關，miR-383可能通過參與調控結腸癌細胞的增殖、遷移與侵襲而參與結腸癌的發生、發展。

PRDX3作為PRDXs家族成員之一，在細胞抗氧化及細胞增殖分化等生理病理過程中具有重要作用，有研究表明，PRDX3在多種腫瘤組織中存在高表達[18-19]。陳錫彬等[6]研究表明，PRDX3在前列腺癌組織中表達比良性前腺增生組織中高，有可能成為鑒別前列腺癌與良性前列腺增生的新型腫瘤標記物。SHI等[20]研究表明，PRDX3在肝細胞癌患者血清中表達水平升高，血清PRDX3表達水平與甲胎蛋白水平、腫瘤直徑、TNM分期和門靜脈侵犯密切相關，與患者生存率呈負相關。BYUN等[21]研究表明，與正常子宮內膜組織比較，PRDX3在子宮內膜癌中高表達，可能與預后不良有關。張大偉等[22]研究顯示，PRDX3在結腸癌組織中陽性表達率為63.16%，且與腫瘤最大徑、浸潤深度、脈管內瘤栓密切相關。本研究結果顯示，結腸癌組織中PRDX3 mRNA表達水平顯著高于正常結腸黏膜組織，且結腸癌組織中PRDX3蛋白陽性表達率為64.71%，高于正常結腸黏膜組織的29.55%，這與張大偉等[22]研究結果一致。本研究分析了PRDX3與臨床病理特征的關系，結果顯示，PRDX3表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關，提示PRDX3可能促進結腸癌的發生、發展。

王少增等[23]研究表明PRDX3在人髓母細胞瘤組織、人髓母瘤細胞系中存在過表達情況，而miR-383可能通過下調PRDX3表達水平來抑制人髓母瘤細胞系的增殖，并促進其凋亡。本研究結果顯示，結腸癌組織中miR-383表達水平和PRDX3 mRNA呈負相關，經TargetScanHuman軟件預測顯示，miR-383和PRDX3存在靶向結合位點，提示miR-383靶向調控PRDX3促進結腸癌的發生、發展。本研究還發現，miR-383高表達組結腸癌患者3年累積生存率顯著高于miR-383低表達組患者；PRDX3高表達組結腸癌患者3年累積生存率顯著低于PRDX3低表達組患者，提示miR-383、PRDX3可能通過調控腫瘤發展影響患者預后情況。進一步研究發現，結腸癌低分化、淋巴結轉移、miR-383低表達、PRDX3高表達是結腸癌患者不良預后的獨立危險因素，提示miR-383、PRDX3可能作為評估結腸癌患者不良預后的生物標志物。

綜上所述，結腸癌組織中miR-383低表達、PRDX3高表達，且與患者腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及生存情況有關，可能作為結腸癌患者預后評估的分子標志物。