T淋巴細胞檢測及PS外翻評估GVT效應抗結腸癌的實驗研究*

王維 韓光宇 宋國權 李海林

結腸癌是全世界主要的消化道惡性腫瘤之一，部分患者在發現癥狀時往往伴有腹腔轉移[1]。異基因造血干細胞移植是作為針對免疫應答的靶向治療[2]，即移植物抗腫瘤（GVT）效應對結腸癌的治療效果[3]。通過異基因造血干細胞移植模型，由脾淋巴細胞輸注聯合環磷酰胺治療提高同種異體移植物的耐受能力[4]。在相關研究中發現PS 外翻是腫瘤細胞常見的現象，存在于原發的惡性病變[5]以及轉移腫瘤細胞[6]；同時環磷酰胺也可降低T 淋巴細胞數量[7]。因此通過利用流式細胞儀檢測小鼠CT-26結腸癌模型中外周血T 淋巴細胞及腹水中癌細胞PS 外翻表達情況評估小鼠GVT 效應，判斷治療結腸癌的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 鼠源CT-26 結腸癌細胞購買于ATCC 細胞庫CRL-2638。

1.2 主要儀器與試劑 流式細胞儀（BD），胎牛血清（FBS）（Hyclone），淋巴細胞分離液（碧云天公司），環磷酰胺（江蘇恒瑞制藥廠），PE-抗-CD4（Biolegend），FITC-抗CD3 抗 體（Biolegend），PS外翻試劑盒（BD）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 細胞培養于含15%胎牛血清的1640 培養基中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱內培養，2 d 進行換液。

1.3.2 結腸癌模型建立 通過將處于對數生長期的鼠源CT-26 結腸癌細胞制備成單細胞懸液，于各組小鼠皮下接種1×106個CT-26 小鼠細胞。

1.3.3 實驗分組 A 組接種瘤細胞不予任何特殊處理；B 組接種于第7 天輸注數量0.5×107/只脾淋巴細胞、第14 天輸注數量0.5×107/只脾淋巴細胞、第21 天輸注數量1.0×107/只脾淋巴細胞；C 組接種第3 天腹腔注射環磷酰胺100 mg/kg（20 mg/mL），于第7 天輸注數量0.5×107/只脾淋巴細胞、第14天輸注數量0.5×107/只脾淋巴細胞、第21 天輸注數量1.0×107/只脾淋巴細胞。

1.3.4 流式細胞檢測外周血T 淋巴 BALB/C 眼底靜脈采血。各管分別為：（1）IgG1/IgG2 10 μL；（2）CD3 10 μL。在室溫暗室下加入紅細胞裂解液1 mL，室溫下避光放置10 min，1 000 r/min 離心5 min，底物用PBS 洗滌2 mL，1 000 r/min 離心5 min，棄上清加入1 mL PBS，上機進行檢測。

1.3.5 流式細胞儀檢測腹水PS 外翻 用1mL注射器抽小鼠腹水，1 500 r/min 離心5 min收集。100μL 的Binding Buffer懸浮細胞。1μL Annexin V-EGFP 混勻后，同時加入1μL Propidium Iodide混勻。每只流式管加入500μL Binding Buffer，上機進行檢測。

1.4 統計學處理 兩組間計量資料的比較分析根據資料是否符合正態分布采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗；多組間計量資料的比較分析根據資料的方差是否齊同采用方差分析或Kruskal-Wallis 檢驗。計數資料采用卡方檢驗或Fisher 精確概率檢驗進行比較。兩組生存時間的比較采用Log-rank 檢驗（又稱Mantel-Cox 檢驗）。采用 SPSS 22.0 和 GraphPad Prism 9.3 軟件進行統計分析和繪圖。P<0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血T 淋巴細胞亞群比例 流式細胞儀檢測小鼠外周血CD3+T 細胞的百分比，其中CD3+T 細胞中A 組為（57.3±3.71）%，B 組為（66.5±3.85）%，C 組為（67.9±4.34）%，C 組較A 組高，差異有統計學意義（t=3.51，P<0.05），B 組較A 組高，差異有統計學意義（t=3.26，P<0.05），B 組與C 組比較差異無統計學意義（t=1.51，P>0.05），見圖1。

圖1 T淋巴細胞亞群比例

2.2 PS 外翻情況 A 組PS 外翻表達陽性率為（79.1±2.1）%，B 組與C 組均無腹水。實驗進行到第14 天檢測PS 外翻情況，A 組為（84.7±4.53）%，B 組 為（83.3±2.15）%，C 組 為（80.6±2.23）%，三組比較差異無統計學意義（F=2.36，P=0.17）。實驗進行到第21 天檢測PS 外翻情況，A 組為（85.4±1.1）%，B 組 為（58.3±3.31）%，C 組為（51.8±1.72）%，A 組與B 組、A 組 與C 組比較，差異均有統計學意義（t=2.12，P<0.05；t=3.74，P<0.05）。見圖2。

圖2 PS外翻表達情況

3 討論

關于預測腫瘤的標記物一直是目前研究的重點方向，腫瘤細胞在發生發展過程中會出現PS 外翻情況，相關研究發現PS 可以作為腫瘤的標記物[8-9]。由于PS 可以作為腫瘤細胞的標記物，因此可以考慮作為新的治療標記物[6]。關于PS 外翻在惡性腫瘤中的相關表達于1991 年已經進行了相關報道[10-11]。腫瘤細胞膜表達PS 現象[12-13]，不僅可以作為凋亡的信號[14]，而且可以作為標記物和治療靶點[15-16]。通過實驗分組發現B 組、C 組PS 外翻表達情況均較A 組下降明顯，因此可以作為臨床診斷指標。T細胞變化是決定著異基因免疫治療的成敗[17-19]，因此通過檢測T 細胞分群可以明確治療效果[20]。實驗發現B、C 組在淋巴細胞輸注后，CD3+T 細胞表達均較A 組顯著上升（P<0.05）。本實驗利用流式細胞儀檢測結腸癌小鼠CT-26 外周血T 淋巴細胞分群及腹水PS 外翻情況可以反映誘導小鼠GVT 效應，評估結腸癌的療效。