microRNA-10調控PTEN基因在促進胰腺癌細胞增殖和遷移的作用*

劉玉蘭 何鳳屏 郭偉強 劉英 黃從云 李定云 黃亮 陳曉旋

胰腺癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。近年來，隨著我國人民的生活節奏加快及飲食結構的改變，胰腺癌發病率呈明顯上升趨勢。目前的腫瘤標志物CEA 和CA-199 聯合檢測對胰腺癌診斷的靈敏度僅為45%左右[2]，特別需要一種敏感性和特異性高的標志物。microRNA（miRNA）是一類非編碼小分子的18～24 個核苷酸的單鏈RNA。miRNA 通過降解或抑制mRNA 的翻譯來抑制靶基因的表達[3]。miRNA 在腫瘤的發生發展過程中起到調控靶基因的重要作用[4]。張力蛋白同源物基因（PTEN）是腫瘤抑制基因，具有脂質和蛋白雙重磷酸活性，在細胞生長、增殖、生存、凋亡、血管生成、細胞遷移和侵襲等方面發揮重要作用[5]。PTEN在腫瘤中表達下調或者發生缺失突變時，可激活PI3K/Akt 信號通路，從而引起腫瘤的發生發展、侵襲和轉移[6]。

miRNA 能在腫瘤組織內穩定表達，還能穩定存在于血清、血漿、全血中[7-9]，可作為一種無創的腫瘤診斷標志物。Liu 等[10]研究發現miRNA在胰腺癌患者循環血中的表達明顯上調，但是，miRNA-10 調控PTEN 促進胰腺癌細胞增殖和遷移的作用機制未見有報道。因此，本文通過研究miRNA-10 調控PTEN 在胰腺癌的表達、與病理分期的相關性以及生物學功能，為預測患胰腺癌的風險和預后監測提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 在粵北人民醫院肝膽外科選取2017 年3 月-2019 年9 月住院并病理診斷證實為胰腺癌的患者80 例作為研究組，所有患者術前均未接受放射治療、化學藥物、免疫治療。另選取同期健康體檢者80 例作為對照組。（1）納入標準：①病理確診為胰腺癌；②未經任何放療、化療等治療。（2）排除標準：①合并其他惡性腫瘤病史；②家族遺傳性糖尿病。本研究已通過汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑及儀器 總RNA 提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供，miRNA-10 和PTEN 試劑盒與內參U6上下游引物由廣州銳博生物有限公司提供。實時熒光定量PCR 檢測使用BIO-RAD CFX96 型儀器（美國BIO-RAD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 采集樣本 所有研究對象靜脈采血3 mL，采用EDTA 抗凝劑，在3 300 r/min 下離心16 min，然后，選取血漿，放置于Eppendorf 管，在10 ℃的環境下，進行15 000 r/min 離心7 min，去除雜質和細胞碎片，將血漿于-80 ℃冰箱保存及以備。選取胰腺原發腫瘤組織及距離腫瘤邊緣至少5 cm 的癌旁正常組織，在12 min 內放置液氮保存。取液氮保存胰腺組織約500 mg，研磨至極細碎末狀，加入1 mL Trizol，用于提取總RNA。

1.3.2 總RNA 提取 在凍存的血漿進行復溫，嚴格按照提取RNA 說明書進行操作。采用紫外分光光度儀測定所提取RNA 的濃度及純度，其A260/A280 比值應在1.5～2.0 間，用于進一步實驗。

1.3.3 逆轉錄反應 按照說明書進行操作逆轉錄試劑盒中的特異性反轉錄引物和合成cDNA，逆轉錄體系20 μL，逆轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存逆轉錄產物。

1.3.4 qPCR 反應 qPCR 反應體系和反應條件參照試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 胰腺癌細胞培養及轉染 將人胰腺癌細胞株PANC-1 細胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培 養 液10 mL，4 ℃以800 r/min 離 心5 min，棄去上清液，重懸后將細胞加入RPMI 1640 培養基中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞融合至80%～90%時傳代。（1）四甲基偶氮唑鹽（4-methylcyclohexanone，MTT）法檢測細胞增殖[10]：分別以每孔103細胞密度將3 組人胰腺癌細胞株PANC-1 細胞接種于96 孔培養板，以培養液為空白對照，分別培養1、2、3、4 d。每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，37 ℃繼續培養4 h 后終止培養，棄去培養液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩、室溫孵育10 后，測定波長493 nm 處各孔吸光度（A 值）。繪制細胞生長曲線是根據時間擬為橫坐標，根據A 值擬為縱坐標。（2）克隆形成實驗：以100、200、400 個細胞的密度分別將3 組人胰腺癌細胞株PANC-1 細胞接種于培養皿中，靜止培養2 周。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時（≥50 個細胞的為一個克隆），終止培養，棄去培養液。平板克隆形成率=形成克隆數/接種細胞數×100%。（3）劃痕實驗：收集各組細胞，以5×103/L 密度接種于96 孔板中，待細胞融合約90%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕，PBS 洗滌3 次，加入無血清培養基，放置在37 ℃、5%CO2培養箱24 h 后，觀察細胞遷移軌跡，拍照記錄。

1.4 靶基因的預測 應用生物信息學軟件TargetScan 6.2、miRDB 和PicTar 預測miRNA-10 的靶基因，發現PTEN 基因可能為其潛在的靶基因。

1.5 統計學處理 采用SPSS 21.0 軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗；采用Spearman 分析CRC 患者血清miRNA-10 與PTEN 表達水平的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 研究組，男50 例，女30 例；年齡37～68 歲，平均（57.91±5.36）歲；根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）和國際抗癌聯盟（UICC）胰腺癌TNM 分期標準[10]：Ⅰ期3 例，Ⅱ期27 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期22 例。對照組，男45 例，女35 例；年齡45～65 歲，平均（56.39±5.24）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組血漿中miRNA-10 和PTEN mRNA 的表達水平比較 經實時熒光定量PCR 檢測，結果顯示研究組血漿中miRNA-10 mRNA 表達水平為（5.37±1.48），高于對照組的（0.46±0.24），PTEN mRNA表達水平為（0.34±0.13），低于對照組的（7.86±1.64），差異均有統計學意義（t=23.69，P=0.000；t=29.18，P=0.000）。

2.3 研究組組織中miRNA-10、PTEN mRNA 表達與病理特征及臨床分期的關系 不同TNM 分期患者miRNA-10、PTEN mRNA 表達水平：Ⅰ期為（2.26±1.09）、（0.83±0.47），Ⅱ期 為（3.17±1.83）、（0.58±0.31），Ⅲ期 為（5.04±2.06）、（0.29±0.16），Ⅳ期為（6.13±2.47）、（0.29±0.16）。不同TNM 分期患者miRNA-10 和PTEN mRNA 表達水平比較，差異均有統計學意義（F=820，P=0.000；F=1 170，P=0.000）。

2.4 miRNA-10 和PTEN mRNA 在胰腺癌患者血漿中表達的相關分析 miRNA-10 和PTEN mRNA 在胰腺癌患者血漿中表達呈線性負相關（r=-0.716，P<0.01）。

2.5 miRNA-10 在胰腺癌患者血漿和組織中表達的相關分析 胰腺癌患者血漿中miRNA-10 的表達與癌組織中的miRNA-10 表達呈正相關（r=0.938，P<0.01）。

2.6 miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞生長的影響 MTT 法檢測結果顯示，miRNA-10 細胞轉染24、48、72、96 h 的A 值（10.92±1.68、19.85±2.43、25.07±3.52、33.49±4.82）均高于對照組（2.432±0.261、4.471±0.343、4.896±0.392、4.765±0.384），差異均有統計學意義（t=2.008，P=0.047；t=12.609，P=0.006；t=31.387，P=0.000；t=42.698，P=0.000），見圖1。

圖1 轉染miRNA-10 mimics分別在不同時間的PANC-1細胞生長

2.7 miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞增殖的影響 平板克隆形成實驗檢測結果顯示：miRNA-10轉染2 周后，miRNA-10 轉染的細胞克隆數為（380±84）個，明顯高于對照組（70±17）個，差異有統計學意義（t=36.26，P=0.000）。

2.8 miRNA-10 和PTEN 對PANC-1 細胞遷移的影響 劃痕實驗結果顯示：轉染miRNA-10 分別在24、48 h 的PANC-1 細胞中，miRNA-10 劃痕間距為（168.29±8.92）和（141.36±4.86）μm，與對照組的（375.43±19.25）和（368.62±17.71）μm比較，差異均有統計學意義（t=18.293，P=0.000；t=16.897，P=0.000）；PTEN 組為（368.34±18.34）和（359.37±18.38）μm，與對照組比較，差異均無統計學意義（t=0.113，P=0.910；t=0.209，P=0.834），見圖2。

圖2 miRNA-10和PTEN對PANC-1細胞遷移的影響

3 討論

由于miRNA-10 在多種惡性腫瘤組織中的表達具有促癌基因的活性，主要通過對下游靶分子轉錄后水平調控發揮生物效應[12]。miRNA-10 的表達與乳腺癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤的發病有密切關系[13]，特別是miRNA-10 在調控腫瘤細胞增殖和遷移這一方面起到至關重要的作用。國外學者研究發現miRNAs 在胰腺癌患者的表達上調[14]，但是目前胰腺癌的發病機制仍未清楚。為了進一步研究miRNA-10 在胰腺癌中的作用機制，本研究采用實時熒光定量PCR 技術檢測胰腺癌患者血漿和組織中miRNA-10 的表達，發現血漿miRNA-10 與胰腺癌病理分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關，隨著腫瘤惡性度的升高，miRNA-10 表達逐步增高，在胰腺癌伴隨淋巴結轉移的患者miRNA-10 表達明顯增高，并與分化程度相關，miRNA-10 的表達水平在低分化腫瘤組織中高于高分化者。同時還發現miRNA-10 的表達在胰腺癌患者的血清中與癌組織中的表達呈正相關（r=0.938）。國外學者也發現miRNA-10 表達水平與治愈率和生存率呈負相關，上述的研究結果表明了血漿miRNA-10 的表達水平在胰腺癌的發展及惡性轉化過程中發揮重要作用，可作為胰腺癌患者預后評價的指標。

miRNA 通過調控結合靶基因而發揮作用，miRNA-10的靶基因 有PTEN，RECK，TIMP-3，SPRY1、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin[15]。有研究認為PTEN 是miRNA-10的靶基因，miRNA-10 高表達能促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移[16]。Lee 等[17]采用敲除PTEN 基因發現增加腫瘤細胞的惡性程度，促進了腫瘤細胞的侵襲和轉移。Jiang 等[18]研究胰腺癌患者的PTEN 基因突變在腫瘤Ⅲ分期患者居多，隨著腫瘤浸潤深度增加其預后就較差。本課題組通過對多種靶標數據庫進行預測，發現張力蛋白同源物基因（PTEN）可能是miRNA-10 的下游靶點，PTEN 是腫瘤抑制基因，具有脂質和蛋白雙重磷酸活性，在細胞生長、增殖、生存、凋亡、血管生成、細胞遷移和侵襲等方面發揮重要作用。PTEN 在腫瘤中表達下調或者發生缺失突變時，可激活PI3K/Akt 信號通路，從而引起腫瘤的發生發展、侵襲和轉移。

PTEN 基因是目前發現的具有磷酸激酶活性的抑癌基因，人類許多惡性腫瘤中存在著PTEN 功能的失活，并與腫瘤進展有密切相關[19]。Zhang等[20]檢測胰腺癌癌組織PTEN 蛋白的表達，發現與癌旁正常組織（對照組）比較差異有統計學意義（P<0.01），提示PTEN 蛋白表達下調在胰腺癌癌的發生過程中起到極為不良的事件。因此，PTEN 表達水平下調提示在一定的程度上促進細胞惡性轉化和腫瘤轉移。結合本研究發現，采用實時熒光定量PCR 檢測PTEN mRNA 的表達量，隨著病情進展，胰腺癌細胞增殖越活躍、分化程度越低，惡性程度就越高、PTEN mRNA 的表達呈下降趨勢，提示PTEN 表達下調與胰腺癌細胞生長和增殖有密切相關，Ⅰ期和 Ⅱ期分別與Ⅲ期和 Ⅳ期比較，差異均有統計學意義（P<0.01和P<0.001）。近期Zou等[21]研究表明ncRNACASC2 上調PTEN 的活性，抑制PI3K-Akt 通路的作用，通過改善細胞和細胞間質的相互作用，減弱腫瘤細胞的侵襲性。本研究結果也顯示，有淋巴結轉移組PTEN mRNA 明顯低于淋巴結轉移組（P<0.001）。在T 分期的Ⅰ期→Ⅳ期胰腺癌組織PTEN mRNA 表達逐步下降（P<0.001）。以上結果表明在高侵襲、高轉移性的胰腺癌組織中的表達明顯降低或無表達，提示PTEN 表達的下調可能是腫瘤的侵襲程度和轉移增加的主要原因之一，促進胰腺癌發展和轉移的作用。因此，PTEN 基因在一定程度上反映胰腺癌細胞的侵襲和轉移能力等生物學行為特征[22]。總之，隨著病情進展，患者的生存率下降，預示著患者預后極差。

Ma 等[23]研究表明miRNA-10 通過調控通路提高細胞轉移蛋白的表達水平而影響腫瘤的侵襲和轉移能力。Aguennouz 等[24]研究指出miRNA-10 與細胞轉移蛋白是相關聯基因，具有促進神經膠質瘤侵襲的作用，設想在胰腺癌中也會存在這種效應。本研究對轉染細胞的體外實驗表明：在miRNA-10的細胞轉染加速PANC-1 細胞生長；在細胞克隆實驗證實miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞的增殖具有明顯促進的影響；細胞劃痕實驗結果顯示：轉染 miRNA-10 的PANC-1 細胞遷移能力高于PTEN 組和對照組。國外研究顯示miRNA-10 在細胞株和腫瘤組織呈高表達水平，并與患者的生存率成反比，提示miRNA-10 與腫瘤浸潤有密切相關[25]。本文采用qPCR 技術檢測胰腺癌患者血漿和組織中miRNA-10 的表達明顯上調，并發現血漿miRNA-10 與胰腺癌病理分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關，隨著腫瘤惡性度的升高，miRNA-10 表達逐步增高，病理分期Ⅲ、Ⅳ期明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，差異均有統計學意義（P<0.05）。上述研究結果表明血漿miRNA-10 的水平可作為胰腺癌患者預后評價的指標。本研究通過采用劃痕實驗研究miRNA-10 mimic 調控PTEN 在胰腺癌PANC-1 細胞生長和增殖能力水平，提示了miRNA-10 有很強的促進胰腺癌PANC-1 細胞的遷移能力，表明miRNA-10 高表達和PTEN 低表達均能夠明顯增加腫瘤細胞的遷移，這可能是由于miRNA-10 下調PTEN 基因，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。本文結果顯示miRNA-10 在胰腺癌患者血漿中的表達水平明顯高于健康對照組；PTEN 基因在胰腺癌患者血漿中的表達水平明顯低于健康對照組。兩者在胰腺癌患者血漿的表達呈負相關（r=-0.916），表明miRNA-10 負性調控PTEN 表達可能在胰腺癌的發生發展及惡化過程中發揮重要作用。

綜上所述，miRNA-10 可以促進胰腺癌細胞的增殖和調控細胞凋亡過程，提示miRNA-10 在胰腺癌的發生發展中發揮重要的作用，PTEN 可能是miRNA-10 作用靶點，miRNA-10 的作用是通過負性調控PTEN 基因參與胰腺癌的發生發展、侵襲和轉移，為胰腺癌的輔助診斷提供一個新的檢測指標，也為胰腺癌基因治療的一個新靶點。