免疫熒光雙重染色在結核分枝桿菌肺炎患者中的診斷應用

王仁德

肺結核（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌所引起的一種慢性傳染病，目前仍是威脅全球公共衛(wèi)生健康的重大傳染病[1]。當前由于各種因素的影響，結核分枝桿菌肺炎的發(fā)病例數(shù)依然較多，可嚴重影響患者的身心健康[2]。當前隨著現(xiàn)代結核病控制策略的廣泛實施，結核分枝桿菌肺炎的死亡率有了明顯下降，但是治療周期仍然維持在12 個月左右，導致患者依從性差，治愈率不盡人意，為此加強早期診斷具有重要價值[3]。當前對于結核分枝桿菌肺炎的診斷方法主要為體外分離培養(yǎng)和涂片鏡檢，雖然準確率比較高，但是存在培養(yǎng)周期長、敏感性低等不足[4]。結核分枝桿菌肺炎的免疫診斷具有簡單、快速、敏感性高、特異性高等優(yōu)勢，主要依靠結核分枝桿菌肺炎侵入宿主的體液和細胞免疫應答而設計，但是很難鑒別結核分枝桿菌感染與環(huán)境中非結核分枝桿菌和接種卡介苗后的致敏狀況[5-6]。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，免疫熒光雙重染色得到了廣泛應用，其可根據(jù)待測物的特性以及檢測的具體條件，篩選出最合適的檢測方法，通過測定復合物上標記物的熒光強度，即可確定樣品中待測抗原含量，從而進行臨床診斷[7]。本文具體探討與分析了免疫熒光雙重染色在結核分枝桿菌肺炎患者中的診斷應用，以促進免疫熒光雙重染色的臨床應用。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年3 月-2021 年3 月在佳木斯市腫瘤醫(yī)院診治的結核分枝桿菌肺炎患者66 例作為結核組，同期選擇非結核分枝桿菌肺炎患者66 例作為非結核組。納入標準：兩組患者均符合肺炎的診斷標準[8]；結核組直接痰涂片鏡檢2 次痰菌陽性，胸片顯示有活動性肺結核病變陰影；病程≥3 年；年齡20～80 歲；小學及以上文化水平。排除標準：妊娠與哺乳期婦女；合并有腫瘤的患者；合并有其他傳染性疾病的患者；診治期間死亡的患者；臨床資料缺乏的患者；不配合調查的患者；合并有精神疾病患者；標本污染或懷疑污染者。患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集所有患者的胸腔積液標本，患者完成鹽酸利多卡因局部麻醉后，超聲引導下胸腔穿刺引流進行采集標本（≥5 mL），把采集的標本分為三份，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 涂片鏡檢-熒光染色法檢測 取所有患者第一份樣本，渦旋振蕩混勻后吸取5 mL 到無菌離心管中，按照體積比1︰1 加入濃度為4.0%的氫氧化鈉溶液。液化樣本后，室溫靜置15 min，3 000 r/min 離心10 min。取沉淀涂抹于玻片正面，干燥后進行熒光染色鏡檢。熒光染色鏡檢過程包括初染-脫色-復染，然后進行熒光顯微鏡鏡下觀察，在×40 物鏡下觀察結核分枝桿菌的形態(tài)并計數(shù)。

1.2.2.2 免疫熒光雙重染色法檢測 取第二份樣本行免疫熒光雙重染色法染色，熒光標記物為以FITC標記的羊抗兔IgG 兔抗結核分枝桿菌多克隆抗體PPD 和以Cy5 標記的羊抗鼠IgG 鼠抗ESA-T-6 單克隆抗體。免疫熒光雙重染色后采用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察，雙重熒光標記選用波長為405 nm和635 nm，采用雙通道同時接收信號成像。所有檢測結果都由檢驗科資深醫(yī)師（工作年限≥10 年，職稱為副高及其以上）進行判定。同時取所有患者的第三份樣本進行胸腔積液生化指標檢測，檢測指標包括胸腔積液腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、總蛋白（total protein，TP）、葡萄糖（glutamate，GLU）等。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組肺炎病程、受教育年限、體重指數(shù)、性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組胸腔積液標本生化指標比較 結核組的ADA、LDH、TP、GLU 水平均高于非結核組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組胸腔積液標本生化指標比較（±s）

表2 兩組胸腔積液標本生化指標比較（±s）

2.3 不同方法結核分枝桿菌檢出率比較 在66 例結核分枝桿菌肺炎患者中，涂片鏡檢-熒光染色法檢出57 例，檢出率為86.4%（57/66）；免疫熒光雙重染色法檢出65 例，檢出率為98.5%（65/66），不同方法結核分枝桿菌檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.033，P=0.005）。

2.4 診斷敏感度與特異度 在兩組132 例患者中，涂片鏡檢-熒光染色法的診斷敏感度與特異度分別為84.8%和98.5%，免疫熒光雙重染色法的診斷敏感度與特異度分別為98.5%和100%，見表3。ROC 分析顯示涂片鏡檢-熒光染色法與免疫熒光雙重染色法的曲線下面積分別為0.822 和0.984。見圖1、2。

表3 不同方法在結核分枝桿菌肺炎患者診斷中的敏感度與特異度（例）

圖1 涂片鏡檢-熒光染色法診斷結核分枝桿菌肺炎的ROC曲線

3 討論

圖2 免疫熒光雙重染色法診斷結核分枝桿菌肺炎的ROC曲線

結核分枝桿菌肺炎是一種由空氣傳播的慢性傳染性疾病，當前由于流動人口增多以及耐藥結核病的發(fā)展，使得結核分枝桿菌肺炎重新成為人們比較關注的公共衛(wèi)生問題[9]。結核分枝桿菌肺炎與非結核分枝桿菌肺炎在臨床特征上比較類似，癥狀具有復雜性和特殊性，對于鑒別診斷的要求比較高[10]。涂片鏡檢-熒光染色法為結核分枝桿菌的常規(guī)檢測方法，特別是結核分枝桿菌對熒光染料有親和性，從而可以被染上熒光[11]。而進行熒光染色鏡檢具有敏感性高、無汞蒸氣污染、操作成本低、操作過程簡單、熒光性強等特點，但是診斷的敏感度有待提高[12]。

胸腔積液生化指標檢測的敏感性更低，存在很多局限性，易出現(xiàn)誤診進而影響患者治療[13]。現(xiàn)代研究表明結核分枝桿菌為一種胞內寄生菌，侵入機體后可被單核巨噬細胞吞噬，且機體受到結核分枝桿菌感染后，在機體內可出現(xiàn)結核分枝桿菌特異性抗原，為此進行結核抗原的檢測具有一定的臨床價值[14]。本研究顯示結核組的胸腔積液標本ADA、LDH、TP 與GLU 水平均高于非結核組（P<0.05）；在66 例結核分枝桿菌肺炎患者中，涂片鏡檢-熒光染色法檢出57 例，檢出率為86.4%；免疫熒光雙重染色法檢出65 例，檢出率為98.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明免疫熒光雙重染色在結核分枝桿菌肺炎患者中的應用具有更高的檢出率。從機制上分析，結核分枝桿菌的細胞學免疫檢測也具有快速、高效等特征，其中結核菌素純化蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）是一種包含有多種不同變性階段蛋白質的混合物，已長期運用于結核分枝桿菌的檢測[15-16]。但是其單獨使用的特異性比較差，其許多成分與卡介苗和非結核分枝桿菌的抗原成分相同。早期分泌性抗原靶6（early secretory antigen target-6，ESAT-6）由RD1 區(qū)編碼，為結核分枝桿菌感染早期所分泌的蛋白，只存在于結核菌群中，為此其檢測能有效的區(qū)分結核菌感染和卡介苗接種情況，涂片鏡檢-熒光染色法與免疫熒光雙重染色法的聯(lián)合使用可提高對于結合分枝桿菌肺炎的臨床檢出率[17]。

結核分枝桿菌肺炎的控制是一個系統(tǒng)的過程，及時有效的診斷具有重要價值。免疫熒光雙重染色分析可利用累加多次激發(fā)后的熒光信號，熒光衰變時間長，可提升檢測準確度與特異度[18]。ESAT-6可通過誘導含NLR 家族PYRIN 域蛋白3（NLRP3）炎癥小體的活化，從而引起巨噬細胞的壞死和炎癥反應。PPD 可反應機體的中性粒細胞變化情況，也可介導分枝桿菌抗原引起的CD4+T 細胞介導遲發(fā)型超敏反應[19]。本研究顯示在兩組132 例患者中，涂片鏡檢-熒光染色法的診斷敏感度與特異度分別為84.8%和98.5%，免疫熒光雙重染色法的診斷敏感度與特異度分別為98.5%和100%；ROC 分析顯示涂片鏡檢-熒光染色法與免疫熒光雙重染色法的曲線下面積分別為0.822 和0.984，表明免疫熒光雙重染色在結核分枝桿菌肺炎患者中的診斷應用具有很高的敏感度與特異度。從機制上分析，免疫熒光雙重染色可以避免結核病患者由于免疫應答低下導致的免疫檢測假陰性。同時激光掃描共聚焦顯微鏡具有高分辨率高、敏感度高等特點，還可通過累加多次激發(fā)后的熒光信號，同時檢測多種物質提高檢測效率，檢測過程不受蛋白類物質穩(wěn)定性和空間結構的影響，從而具有很高的診斷價值[20-21]。本研究由于經(jīng)費與人力限制，沒有進行大樣本量分析，也沒有設置正常對照組，將在后續(xù)研究中探討。

綜上所述，免疫熒光雙重染色在結核分枝桿菌肺炎患者中的應用診斷敏感度與特異度都在98.0%以上，可提高檢出率，可為結核分枝桿菌肺炎的早期診斷提供一定的依據(jù)。