液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜法測定牛奶中8種氨基糖苷類抗生素殘留

劉善菁，宋慧敏，曲 斌，陸桂萍，劉雨昕

(江蘇省獸藥飼料質量檢驗所，南京 210036)

氨基糖苷類抗生素(Aminoglycosides，AGs)是以堿性環己多元醇為苷元，與氨基糖縮合而成的苷。自1944年科學家從鏈霉菌中分離出第一個氨基糖苷類藥物鏈霉素開始，20年間，其他氨基糖苷類藥物先后從鏈霉菌(新霉素)和絳紅小單孢菌(慶大霉素)中分離出來并逐步開發出了半合成衍生物，包括阿米卡星、卡那霉素等[1]。AGs具有較強的耳毒性和腎毒性，其中鏈霉素的耳毒性最大，新霉素的腎毒性最大[1]。因其毒性作用，AGs一般被用來治療嚴重感染。新霉素和鏈霉素制劑可用于治療牛犢細菌性腸炎、牛乳腺炎等[1-2]。

基于AGs顯著的毒副作用，我國在GB 31650-2019[3]中對鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、安普霉素以及大觀霉素6種AGs的限量作出了明確規定，牛奶中AGs最大殘留限量在150～1500 μg/kg之間。AGs的測定一直是獸藥殘留分析的難點之一。由于AGs自身無發色基團，無紫外吸收，需要進行衍生化反應才能通過液相色譜法測定。因此，前處理更加簡便的液相色譜-串聯質譜法在AGs殘留分析中應用非常普遍。

AGs分子結構中存在多個羥基與氨糖基，堿性和極性較強，在普通C18柱上幾乎沒有保留。如果想通過反相色譜法分析AGs，只能引入離子對試劑如七氟丁酸[4-5]或者衍生化試劑如異氰酸苯酯[6]。這些離子對試劑的引入會導致質譜檢測器污染，引發離子抑制、靈敏度降低、峰形變差等諸多問題。因此，適合分析強極性、強親水性化合物且無需使用離子對試劑的親水作用色譜(HILIC)法得到了廣泛應用。Federica L等[7-9]應用HILIC方法分別測定了雞肉、牛奶、豬肉與豬腎中的AGs。但是HILIC色譜法也有一定的局限性，需要在流動相中引入較高濃度的緩沖鹽(通常為甲酸銨或乙酸銨)以增強保留，而高鹽濃度的流動相同樣會影響檢測器靈敏度[10]。

本文選用的Obelisc R色譜柱是一種采用了新型“液態分離池技術(Liquid Separation Cell technology, LiSC) ”的混合型離子交換色譜柱。據文獻報道[8,11-12]，應用Obelisc R色譜柱分離氨基糖苷類藥物，可以在不使用緩沖鹽流動相的情況下獲得滿意的分離度和靈敏度。與此同時，本文采用分子印跡固相萃取小柱對氨基糖苷類化合物進行特異性保留與凈化。本文研究建立了同時測定牛奶中8種氨基糖苷類藥物的液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜方法，在避免離子對試劑、緩沖鹽流動相對質譜損傷的基礎上，有效提高了方法靈敏度，提供了一種快速、靈敏測定牛奶中AGs的新方案。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備 Thermo Q-ExtractiveTM液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用儀、Heraeus Multifuge X1R離心機，美國ThermoFisher公司；MS3 basic 渦旋儀、KS501 振蕩器，德國IKA公司；MV5全自動氮吹儀，美國LabTech公司；LINK BLOW 氮氣發生器，金浪科技有限公司。

1.2 試劑與材料 乙腈(色譜純)，德國Merck公司；乙酸(色譜純)、乙酸銨(色譜純)，美國Anaqua Chemicals Supply公司；三氯乙酸(分析純)、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O,分析純)、氫氧化鈉(分析純)購自南京化學試劑有限公司；所用水為超純水。SupelMIP Aminoglycosides分子印跡固相萃取柱，50mg/3mL，美國Supelco公司;Oasis WCX固相萃取凈化柱，60mg/3mL, 美國Waters公司;Bond Elut CBA, 100mg/3mL，美國Agilent公司;聚丙烯離心管,美國ThermoFisher公司;聚丙烯進樣瓶,美國Agilent公司。

標準品純度及來源：硫酸鏈霉素(Streptomycin sulfate, STR)90.3%;硫酸雙氫鏈霉素(Dihydrostreptomycin sesquisulfate, DHSTR)93.2%;慶大霉素(Gentamicin, GEN)94.4%，含GEN C1 29.1 %、GEN C1a 21.3 %、GEN C2 49.6 %;硫酸安普霉素(Apramycin Sulfate, APR)81.5%;大觀霉素(spectinomycin，SPC)98.0%;硫酸卡那霉素(Kanamycin, KANA)90.1%;阿米卡星(Amikacin, AMK)99.1%;硫酸新霉素(Neomycin sulfate, NEO)86.5%;標準品均購于Dr. Ehrenstorfer公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標準溶液的配制 精密稱取各氨基糖苷類標準品約10 mg，分別于100 mL量瓶中，用水溶解并定容，制成100 μg/mL的標準儲備液，轉移至塑料瓶中，于4 ℃冷藏保存。精密量取各氨基糖苷儲備液1 mL分別于100 mL量瓶中，用水稀釋成1 μg/mL的標準工作液，轉移至塑料瓶中，于4 ℃冷藏保存。

1.3.2 氨基糖苷類提取液(5%三氯乙酸，10 mmol/L乙酸銨，0.4 mmol/L EDTA) 取三氯乙酸50 g，乙酸銨0.771 g，Na2EDTA·2H2O 0.149 g，用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.3.3 5 mol/L氫氧化鈉溶液 取氫氧化鈉20 g，用水溶解并稀釋至100 mL。

1.3.4 氨基糖苷類洗脫液(100 mmol/L乙酸銨,pH3)

取乙酸銨7.708 g，加入800 mL水溶解，用乙酸調節pH至3，用水定容至1000 mL。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為SiELC Obelisc R色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm，美國SIELC公司)。流動相A為1%甲酸水溶液，流動相B為1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～2 min保持95% B；2～2.5 min線性變化到20% B；2.5～5.5 min保持20% B；5.5～6 min線性變化到95% B；6～10 min保持95% B。流速：0.4 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

1.4.2 質譜條件 高能電噴霧離子源(high-electro spray ionization, H-ESI)；正離子模式；噴霧電壓：4000 V；霧化氣：40 L/h；輔助氣：15 L/h；離子傳輸溫度：350 ℃；輔助加熱溫度：400 ℃；檢測方式為平行反應監測模式(parallel reaction monitoring, PRM)；分辨率：17500 (FMWH) (m/z200)；AGC target：5×104；C-trap最大注入時間：50 ms。目標物及其定量子離子的精確質量數、碰撞能量見表1。

表1 氨基糖苷類化合物及其定量子離子信息Tab 1 Qualitative and quantitative imformation of AGs

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品的提取 稱取試料(2±0.02) g于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL氨基糖苷類提取液，渦旋使之充分混合，振蕩提取15 min，4 ℃下10000 r/min離心10 min。將上清液轉移至另一離心管中，用5 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0±0.5，渦旋混勻，4 ℃下10000 r/min離心5 min，移取全部上清液，備用。

1.5.2 樣品的凈化 SupelMIP Aminoglycosides分子印跡固相萃取柱依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，取1.5.1中備用液上樣，控制流速約1 mL/min，用3 mL水淋洗后真空抽干1 min。用2 mL氨基糖苷類洗脫液洗脫，過0.22 μm水相微孔濾膜于聚丙烯進樣瓶中，待測。

1.6 基質匹配標準曲線繪制 精密量取適宜濃度的氨基糖苷類標準工作液適量，用1%甲酸水溶液稀釋成不同濃度的系列標準工作液(STR為1、2、4、10、20、50 ng/mL；DHSTR、GEN C1、GEN C1a、GEN C2、KANA為0.2、0.5、1、2、5、10 ng/mL；SPC為10、20、40、100、200、500 ng/mL；NEO、AMK、APR為2、5、10、20、50、100 ng/mL)，從中各取2.0 mL，分別加入到空白牛奶經提取、凈化和吹干后的殘余物中，充分溶解，過微孔濾膜，作為系列基質匹配標準溶液上機測定。以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，基質匹配標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程和相關系數。

1.7 方法靈敏度 添加適量濃度的氨基糖苷類混合標準工作液于空白牛奶中，經前處理后測定，觀察藥物特征離子質量色譜峰信噪比(S/N)和對應藥物濃度，以S/N>3作為方法的檢測限，S/N>10作為方法的定量限。

1.8 方法準確度及精密度 采用標準添加法，通過向空白牛奶中添加不同濃度(LOQ、2LOQ、10LOQ或LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL的氨基糖苷類混合標準工作液進行回收率試驗，各濃度進行5個樣品平行試驗，分別考察3批次，按照1.5項樣品前處理方法處理后上機測定，基質匹配標準溶液外標法定量，計算回收率，并用相對標準偏差值(relative standard deviation,RSD)評價批內和批間精密度。

2 結果和分析

2.1 定性分析 本文采用高分辨模式下PRM監測方式，選擇一個母離子和一個子離子進行定性和定量分析，獲得的高質量精度離子可以有效排除干擾離子的影響，定性定量結果準確可靠。100 ng/mL標準溶液色譜圖及對應高分辨質譜圖見圖1，空白牛奶色譜圖及對應高分辨質譜圖見圖2，空白牛奶添加試樣色譜圖及對應高分辨質譜圖見圖3。

根據圖1可確定標準溶液中各化合物豐度最大的子離子，并與圖3(添加試樣)綜合考慮，可確定用于定量的子離子：除大觀霉素外，其余化合物標液與添加圖中豐度最大的子離子完全一致，可以確認為定量離子。大觀霉素標液中響應最大的離子依次為333(分子離子峰)、98和207；分子離子峰不適合作為定量離子，因而需從98和207中選擇一個，添加圖中98響應較小，可能與基質導致的離子抑制有關，而207依然保持較高響應，綜合考慮選擇了207作為大觀霉素定量離子。根據各化合物子離子精確質量數及同位素離子豐度比等信息，儀器自帶軟件可推導出定量子離子的元素組成(表1)；根據元素組成、母離子結構和裂解規律，可以推導出各化合物定量子離子可能的裂解位置(圖4)。

表TR：2 μg/kg；DHSTR、GEN C1、GEN C1a、GEN C2、KANA：0.5 μg/kg；SPC：20 μg/kg；NEO、AMK、APR：5 μg/kg

圖4 8種氨基糖苷類化合物定量子離子可能斷裂位置Fig 4 The most likely fracture positions of eight aminoglycosides quantitative product ion

2.2 基質匹配標準曲線 以氨基糖苷類各化合物的特征離子質量色譜峰面積與其對應的基質匹配標準溶液濃度作圖，得到相應的標準曲線，線性范圍、線性回歸方程及相關系數(R2)見表2。結果表明：鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素(GEN C1、GEN C1a、GEN C2)、安普霉素、大觀霉素、卡那霉素、阿米卡星和新霉素在各自線性范圍內，線性關系良好，R2均大于0.990。

表2 空白牛奶中氨基糖苷類藥物基質匹配標準曲線、線性范圍、相關系數、定量限和檢測限Tab 2 Matrix-matched standard curve, limit of quantitative (LOQ) and limit of detection (LOD) of aminoglycosides in milk

2.3 方法靈敏度 按1.5項中所述方法進行處理，當添加濃度STR 2 μg/kg，DHSTR、GEN C1、GEN C1a、GEN C2、KANA 0.5 μg/kg，SPC 20 μg/kg；NEO、AMK、APR 5 μg/kg時，測得各化合物S/N>10；當添加濃度STR 0.5 μg/kg，DHSTR、GEN C1、GEN C1a、GEN C2、KANA 0.2 μg/kg，SPC 5 μg/kg NEO、AMK、APR 2 μg/kg時，測得各化合物S/N>3；牛奶中各氨基糖苷類化合物的定量限和檢測限見表2。

2.4 方法的準確度和精密度 在空白牛奶中添加不同濃度的各氨基糖苷類藥物的標準工作液(LOQ、2LOQ、10LOQ或LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL)進行回收率實驗，結果見表3。牛奶中8種氨基糖苷類藥物回收率在68.0%～104.6%范圍內，批內與批間RSD均不高于11.3%。

表3 空白牛奶中氨基糖苷類藥物的添加回收率(n=5)Tab 3 Recoveries of aminoglycosides in milk spiked samples

3 討論與結論

3.1 提取溶液的選擇 AGs與樣品基質中的蛋白結合很緊密并且會與金屬離子反應形成螯合物，因此AGs提取液中應加入一定量的EDTA以釋放出待測物。據報道[8,12-14]，AGs提取溶液通常含有2%～10%三氯乙酸、低濃度的EDTA以及乙酸銨或磷酸氫二鉀緩沖溶液。本文參考文獻[11]提取方法，選擇三氯乙酸、0.4 mmol/L EDTA、10 mmol/L乙酸銨溶液作為提取液，并比較了不同濃度的三氯乙酸對提取效果的影響。實驗中發現，當三氯乙酸濃度為2%時，離心后的上清液較渾濁，影響后續固相萃取過程；當三氯乙酸濃度提高至5%時，上清液澄清，且提取效率已達峰值，若繼續強度，可能會影響后續凈化過程，因此最終確定提取液為5%三氯乙酸、0.4 mmol/L EDTA、10 mmol/L乙酸銨溶液。

此外，由于氨基糖苷類藥物易被玻璃和濾紙吸附[10]，因此整個實驗過程中不僅要避免使用玻璃器皿，還需避免過濾操作。

3.2 凈化條件的選擇 AGs的凈化方法與其較強極性和堿性的性質密切相關。文獻報道中多選用C18小柱、HLB小柱[11]、離子交換小柱[8,12-14]、分子印跡固相萃取小柱[10]。分子印跡固相萃取小柱是利用分子印跡聚合物特異性鎖定目標物，再將目標物洗脫下來從而實現凈化與富集。

考慮到C18小柱和HLB小柱凈化時通常會引入易對離子源造成污染的離子對試劑七氟丁酸，因此本文選擇了2種陽離子交換固相萃取柱Oasis WCX (60mg/3mL, Waters)、Bond Elut CBA(100mg/3mL, Agilent)，以及1種分子印跡固相萃取柱SupelMIP Aminoglycosides (50mg/3mL，Supelco)，進行了凈化效果的比較。具體操作如下：稱取空白牛奶3份，按20 μg/kg添加混合標準溶液，按1.5項樣品前處理方法處理，分別經3種不同柱凈化。由圖5可見，分子印跡固相萃取柱對待測物的凈化效果最好，回收率最高。當使用WCX小柱凈化時，STR、DHSTR回收較高，但GEN和NEO幾乎無回收；當使用CBA小柱凈化時，各待測物都有一定程度保留但均低于分子印跡固相萃取柱。因此，本文選擇了能夠特異性保留氨基糖苷類化合物的分子印跡固相萃取柱進行凈化。

圖5 不同凈化方式對分析物響應的影響Fig 5 Purification method effect on response

3.3 洗脫溶液的選擇 文獻報道中涉及的AGs洗脫溶液通常有3類：含少量七氟丁酸的緩沖溶液；含5%甲酸的甲醇或乙腈溶液；酸性乙酸銨或甲酸銨緩沖溶液(緩沖鹽濃度在50～175 mmol/L之間，溶液pH3)。本文比較了5%甲酸乙腈[4,14]和175 mmol/L乙酸銨溶液(pH3)[11]的洗脫效果，結果如圖6所示：當乙酸銨溶液作為洗脫液時，各AGs洗脫效率明顯更高，說明乙酸銨溶液(pH3)的洗脫效果遠優于5%甲酸乙腈。隨后又通過實驗比較了不同濃度乙酸銨洗脫液(20、50、100、125、175 mmol/L)對結果的影響，結果如圖7所示：當乙酸銨濃度達到100 mmol/L時，各化合物洗脫效率基本達到峰值，其后即便加大緩沖鹽濃度，回收率也只在一個穩定范圍內略有波動，基本達到平衡狀態，而此時繼續加大洗脫液中鹽濃度反而會增大上機溶液的離子強度從而造成質譜端的不穩定，綜合考慮提取效率與離子強度兩個因素，最終選擇100 mmol/L乙酸銨溶液(pH3)作為洗脫溶液。

圖7 不同濃度乙酸銨對牛奶中AGs洗脫效果研究Fig 7 Research on different concentrations of ammonium acetate solution of AGs in milk

3.4 色譜柱的選擇 本文選擇了適合強極性樣品分析的親水作用色譜(HILIC)法。HILIC色譜柱固定相包括硅膠、氨基、酰胺基、磺酸甜菜堿兩性離子型等[13]。Waters公司 BEH HILIC柱是代表型硅膠分析柱[11]，其固定相僅為BEH雜化顆粒，被稱為“裸柱(bare silica)”，相關文獻[12,15]及實驗[13]表明，AGs與固定相之間的強氫鍵作用會導致大部分AGs難以洗脫、峰形較差，因此能夠分析的化合物非常有限[8,14]。Phenomenex公司Luna NH2柱、Waters公司BEH Amide柱的固定相上分別鍵合了氨基和酰胺基團，主要通過親水分配作用對氨基糖苷類藥物進行分離，流動相中通常含有較高濃度的甲酸銨[11]。Merck公司的ZIC-HILIC兩性離子色譜柱固定相上帶有共價鍵合的永久型磺酸甜菜堿型兩性離子官能團。實驗表明[12-13]，ZIC-HILIC柱可同時分析多種氨基糖苷類藥物并獲得良好的分離度，峰形和靈敏度；但是這種色譜柱仍有一定欠缺：在酸性流動相條件下，堿性的氨基糖苷類化合物帶正電，此時需要引入高濃度的NH4+作為流動相(甲酸銨或乙酸銨)，以競爭抑制帶正電的AGs與帶負電的固定相磺酸根陰離子基團之間的作用，從而加快待測物的洗脫，因此通常需要鹽濃度為100～200 mmol/L的流動相。高鹽流動相引發的鹽沉積現象會導致色譜峰對稱性差，檢測器靈敏度降低等問題[5,16]。本文選用的SiELC Obelisc R色譜柱有效避免了上述3種色譜柱的不足，這種色譜柱采用新型化學修飾方法形成一個液態分離池，類似于活細胞與外界環境之間的平衡，液態分離池存在于一個與流動相不斷平衡的環境中，內部分離池環境與外部(流動相)有很大不同。即使外部流動相為低濃度緩沖鹽，也能實現帶電分析物快速進出分離池的高通量轉換。隨著外環境的變化，液態池內部會變化出新的長疏水鏈或親水鏈，離子化程度、電荷分布和反離子特性都會發生變化，被長的有機鏈分開的分離池配合基正負離子可以使正負電荷同時參與靜電作用，從而實現低濃度緩沖鹽流動相條件下對AGs有效分離。

因此，本文選擇了Obelisc R色譜柱對待測物進行分離，并在此基礎上對方法進一步優化。

3.5 流動相的選擇 本文分別比較了體積分數為0.1%、0.5%、1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相時AGs色譜保留情況。實驗中發現，當甲酸體積分數為0.1%時，僅STR、DHSTR、SPC可以獲得良好的峰形，NEO難以洗脫，其余4種化合物拖尾嚴重；當甲酸體積分數為0.5%時，STR、DHSTR、SPC、APR出現雙峰，其余化合物均有不同程度拖尾現象；當甲酸體積分數為1%時，各化合物均獲得滿意的保留和峰形。因此最終選取1%甲酸水溶液和1%甲酸乙腈溶液作為流動相。

3.6 基質效應 質譜分析過程中，樣品基質中的干擾組分會對目標待測物產生影響，從而產生基質增強或基質抑制效應。本文中評價基質效應的方法是：基質效應=空白基質配制標液響應值/溶劑配制標液響應值×100%。當基質效應在80%～120%之間時，可用標準曲線定量；當基質效應小于80%，為基質抑制效應；當基質效應大于120%時，為基質增強效應，可用基質匹配標準曲線定量。

本文在20 μg/kg添加水平考察了牛奶中AGs基質效應，結果見表4。由表中數據可以看出，STR、DHSTR、SPC、KANA、AMK表現為顯著的基質抑制，GEN、NEO和APR表現為顯著的基質增強。因此，本文選用基質匹配標準曲線進行定量。

表4 氨基糖苷類化合物在牛奶中的基質效應Tab 4 The matrix effect of AGs in milk

3.7 實際樣品分析 運用本文建立的方法進行分析，對本實驗室采集的200批次牛奶樣品進行測定，檢出鏈霉素2批次，含量在37.4～85.2 μg/kg范圍內，其余氨基糖苷類化合物未檢出，檢出樣品符合GB 31650-2019相關規定，未超出限量范圍，200批次樣品均合格。

本文采用 “液態分離池”Obelisc R色譜柱，建立了牛奶中8種氨基糖苷類藥物的液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜方法。該方法靈敏度高、專屬性強，適用于牛奶中氨基糖苷類藥物的定性篩查和定量測定。