HPLC法同時測定和評價“黔中金蕎麥”中4種成分含量

陶小艷，張 濤，周思旋，向清華，唐遠江，趙 宇，盧昱希，史開志

(貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所，貴陽 550004)

金蕎麥[Fagopyrumdibotrys(D. Don) Hara] 屬于蓼科蕎麥屬植物，收錄于《中華人民共和國藥典》、《中華人民共和國獸藥典》和《飼料藥物添加劑允許使用品種目錄》以及《飼料原料目錄》中，其野生品種為國家Ⅱ級重點保護植物[1]，既可作為藥物使用，又可作為飼料以及飼料添加劑使用，適用范圍廣，應用價值高。藥用部位塊狀根莖具有清熱解毒、排膿消腫清肺排痰等功效，歸肺經，對呼吸系統疾病有一定療效，現代藥理研究表明，金蕎麥具有抗菌消炎、解熱鎮痛、抗過敏、增強免疫等作用[2～3]。為了保護和利用好野生金蕎麥這一優質植物資源，貴州省畜牧獸醫研究所以貴州黔中地區野生金蕎麥作為親本，栽培馴化而成牧草新品種“黔中金蕎麥”，其先后通過省級和國家級牧草品種審定。經選育的“黔中金蕎麥”適應性較強、營養價值高、抗病蟲害性強、耐刈割利用、易繁殖，高蛋白低纖維利于消化，是飼養豬、雞、等畜禽喜食的優質青飼牧草[4～5]。艾蓉等以“黔中金蕎麥”替代部分精糧飼喂豬和雞，發現可降低養殖成本、提高經濟收益[6]。鄧蓉等評價“黔中金蕎麥”的種草養畜社會生態效益，發現“黔中金蕎麥”的種植不僅可以提高種植經濟效益，還可提高土壤肥力、改善水土流失[7]。現已廣泛種植并應用于貴州省六盤水、大方、黔西、威寧、息烽等10余個縣(市)的生態畜牧養殖，取得了一定成效[8]。

金蕎麥中的化學成分多以酚酸類、黃酮類和萜類為主，發揮的作用也多是這些化合物。“黔中金蕎麥”作為藥飼兼用、綠色環保的優質牧草，化學成分也比較豐富，但金蕎麥在中國藥典中的含量測定標準是表兒茶素(C15H14O6)，評價指標太過單一，無法全面來評價金蕎麥的質量，因此,本試驗以大中小極性的黃酮類物質及物質總和為指標來綜合評價 “黔中金蕎麥”的質量，采用高效液相色譜法同時測定“黔中金蕎麥”與野生金蕎麥中表兒茶素、原花青素B2、蘆丁和槲皮素4種成分的含量，旨在建立一種簡便快捷、準確可靠的質控方法，以及分析“黔中金蕎麥”與野生金蕎麥在這4種成分含量上的差異，有效控制藥材的內在質量，充分保障其藥用價值。此試驗試驗亦可為“黔中金蕎麥”作為藥用資源選育、飼料添加劑開發以及用于臨床治療提供科學依據。

1 試驗材料

1.1 試驗藥材 2020 年于貴州省畜牧獸醫研究所麥坪試驗基地分別選擇種源、栽培環境和管理條件一致的1～3年生及不同季節栽培地采集“黔中金蕎麥”塊根樣品共5份；從麥坪試驗基地遷至黔西種植的“黔中金蕎麥”塊根樣品1份；在龍里、丹寨、普安、關嶺和羅甸等收集野生金蕎麥塊根共5份，采自石柱(重慶)和云南的野生金蕎麥塊根樣品共2份，總計13份樣品。

1.2 試驗儀器與耗材 LC-20A高效液相色譜儀(SIL-20A 自動進樣器，SPD-20A 檢測器，日本島津公司)；C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本GL Sciences公司)；電子天平(A-R1140，瑞士梅特勒-托利多上海有限公司公司)；旋轉蒸發儀(N-1300，上海愛朗儀器有限公司)；恒溫數字顯示水浴鍋(HH-6，科密儀器儀表有限公司)；超聲波清洗機(JT-410HT，深圳市潔拓超聲波清洗設備有限公司)；0.45 μm微孔濾膜(島津(上海)實驗器材有限公司)；聚酰胺(30-60目，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 試驗試劑與藥品 無水乙醇(分析純，重慶川東化工(集團)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；磷酸(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；表兒茶素、原花青素B2和蘆丁標準品(編號：C100865、C100664和C100001，貴州迪大科技有限公司)，槲皮素標準品(批號：ALT600928，天津阿爾塔科技有限公司)。

2 試驗方法

2.1 標準品溶液制備 精密稱量原花青素B2標準品0.0100 g、表兒茶素標準品0.0100 g、蘆丁標準品0.0100 g、槲皮素標準品0.0100 g，分別加適量色譜甲醇于10 mL的容量瓶中，超聲溶解后定容，得各標準品溶液母液，備用。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥、粉碎后的藥材2.00 g于燒瓶中，加80%乙醇40 mL，浸泡過夜，加熱回流提取2 h，過濾后取全部濾液于水浴鍋上揮干，加色譜甲醇溶解后轉移至10 mL的容量瓶中，定容，離心取上清液5 mL過聚酰胺柱，先用50 mL的蒸餾水洗脫，棄掉水洗液，再用150 mL的無水乙醇洗脫，濃縮醇洗液，溶解、轉移、定容至10 mL的容量瓶中，得供試品溶液，進樣前搖勻，并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，備用。

2.3 色譜條件 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)梯度洗脫，進樣量10 μL，檢測波長254 nm，溫度30 ℃。梯度洗脫見表1。

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表1 梯度洗脫條件Tab 1 Procedore of gradient elution

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察 取適量原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素標準品溶液母液，分別配置成5、25、45、65、85 μg/mL的濃度梯度溶液， 5、10、20、40、80 μg/mL的濃度梯度溶液， 0.5、1、2、4、8 μg/mL的濃度梯度溶液， 0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL的濃度梯度溶液，按2.3項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，繪制標準曲線。

2.4.2 精密度考察 精密吸取含原花青素B2100 μg/mL、表兒茶素100 μg/mL、蘆丁100 μg/mL、槲皮素100 μg/mL的混合對照品溶液10 μL，按2.3項下色譜條件進樣測定，重復6次，記錄色譜圖，測定峰面積，計算其RSD值。

2.4.3 重復性考察 精密稱“黔中金蕎麥”(黔西)的干燥粉末6份，每份約2.00 g，按照2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，計算其RSD值。

2.4.4 穩定性考察 精密吸取“黔中金蕎麥”(黔西)制成的供試品溶液10 μL，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h按2.3項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，計算其RSD值。

2.4.5 回收率測試 采用加樣回收法，精密稱取6份已知含量的黔中金蕎麥(黔西產)約1 g，分別精密加入混合對照品20 mL(用色譜甲醇配置成的含原花青素B234 μg/mL、表兒茶素18.75 μg/mL、蘆丁3.45 μg/mL、槲皮素0.85 μg/mL)，按2.2項方法提取制備供試品，按2.3項色譜條件測定，計算其峰面積。

2.4.6 樣品測試 取測試試驗藥材按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，根據各對照品標準曲線計算樣品含量。

3 結果與分析

3.1 線性關系考察 以標準品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制各對照品的標準曲線，各對照品標準曲線如下：原花青素B2：y=1922.3x-192.8(r2=0.9998)；表兒茶素：y=2190.3x-119(r2=0.9998)；蘆丁：y=22572x+652(r2=0.9996)；槲皮素：y=33687x-89.8(r2=0.9999)。

3.2 精密度考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.14%、0.10%、0.09%、0.07%(n=6)，表明所用儀器精密度良好。

3.3 重復性考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.83%、1.09%、0.74%、1.50%(n=6)，表明該方法重復性良好。

3.4 穩定性考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.88%、0.80%、1.62%、1.28%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

3.5 回收率試驗 加樣回收試驗結果顯示：原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的平均回收率分別為98.37%、98.68%、96.11%和97.56%，RSD分別為1.02%、1.00%、1.18%和1.01%。以上結果表明此方法檢測“黔中金蕎麥”中原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的含量可靠、穩定。加樣回收率測試結果見表2。

表2 加樣回收試驗(n=6)Tab 2 Sample recovery test(n=6)

3.6 樣品測試 以2.3項下的色譜條件對混合標準品及各供試品進行色譜測定，色譜圖如圖1所示。

1-原花青素B2，2-表兒茶素，3-蘆丁，4-槲皮素

3.6.1 “黔中金蕎麥”與不同產地野生金蕎麥的成分含量 對采自貴州省內不同產地及云南、重慶的野生金蕎麥與“黔中金蕎麥”1年生根莖供試品溶液按照2.3項下色譜條件進樣測定，檢測結果見表3。

從表3中可以看出：在此試驗方法下除關嶺和羅甸產的野生金蕎麥未檢測到槲皮素外，其余樣品均檢測出4種指標成分。“黔中金蕎麥”4種成分的總含量高于除丹寨外的其他野生金蕎麥，采自黔西的“黔中金蕎麥”總含量(1189.70 μg/g)優于采自麥坪的“黔中金蕎麥”(1108.01 μg/g)。“黔中金蕎麥”和黔產的各地野生金蕎麥的含量各不相同，且具有一定差異。原花青素B2和蘆丁的含量“黔中金蕎麥”最高，采自黔西的分別為710.27、71.69 μg/g，采自麥坪的分別為798.79、65.47 μg/g，其中采自麥坪的原花青素B2含量最高(798.79 μg/g)，采自黔西的蘆丁含量和槲皮素含量最高(71.69、17.91 μg/g)；除龍里產的野生金蕎麥槲皮素含量(15.11 μg/g)高于采自麥坪的“黔中金蕎麥”(7.81 μg/g)，采自丹寨的野生金蕎麥表兒茶素含量高最高(588.00 μg/g)外，“黔中金蕎麥”的表兒茶素和槲皮素的含量均高于其他野生金蕎麥。

表3 “黔中金蕎麥”與不同產地野生金蕎麥中4種成分含量(n=2)Tab 3 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" and wild from different origins (n=2)

3.6.2 生長年限對“黔中金蕎麥”的化學成分含量的影響 對采自麥坪不同生長年限的“黔中金蕎麥”根莖供試品溶液按照2.3項下色譜條件進樣測定，檢測結果見表4。

表4 不同生長年限的“黔中金蕎麥”中4種成分含量(n=2)Tab 4 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" with different growth years (n=2)

表4的試驗結果顯示：在4種指標成分含量上，前3種成分含量在第2年采收時含量達到最高，總含量也達最高，槲皮素含量無明顯規律性變化，第3年含量最高，有逐年累計的可能，或者是在生長過程中，蘆丁受影響發生水解產生槲皮素，造成槲皮素含量升高，但第3年時4種成分總含量急劇減少。為充分利用資源，且考慮其總體成分含量以及治療作用，故適宜在“黔中金蕎麥”生長第2年時采收。

3.6.3 采收時間對“黔中金蕎麥”化學成分含量的影響 對不同時間采收的“黔中金蕎麥”根莖供試品溶液按照2.3項下色譜條件進樣測定，檢測結果見表5。

表5 不同采收時間的“黔中金蕎麥”中4種成分含量(n=2)Tab 5 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" at different harvest times (n=2)

表5結果顯示：不同采收時間對4種指標成分含量的影響未呈現出一定的趨勢，6月份與12月份采收在總含量上差異不明顯，總體綜合來看12月采收較好，不僅成分含量高，且金蕎麥地上部分也具有一定的經濟利用價值，能在冬季枯死之前地上部分作為青綠飼料加以利用，降低養殖成本，提高經濟效益。

綜合評價，在此試驗方法下，“黔中金蕎麥”的物質含量豐富，品質佳，其中以來自黔西的“黔中金蕎麥”在此4種指標成分評價下，品質最佳。以12月份、2年生的“黔中金蕎麥”采收最適宜，活性物質成分含量高。

4 討論與結論

金蕎麥中物質成分豐富、復雜，含有各類化學成分，主要是多酚類、黃酮類、甾體類和萜類等化學成分，以較大極性類物質居多，具有治療糖尿病、抗癌、抗氧化、抗菌以及增強免疫等多種藥理作用，是一種具有良好開發前景的中藥。金蕎麥中含有大量黃酮類物質，如表兒茶素、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、兒茶素和原花青素B2等黃酮單聚體和一些二聚體等物質[9]，黃仁術等[10]研究發現其中表兒茶素具有明顯抗菌消炎作用，黔中金蕎麥中表兒茶素含量較高，達到中國藥典含量測定要求，而丹寨產的野生金蕎麥中表兒茶素含量近乎是藥典標準的兩倍。馮黎莎、王立波等[11-12]研究發現金蕎麥的根莖和莖葉都具有一定的抑制細菌和真菌的作用，且金蕎麥中的黃酮以及多酚類化合物對乙型溶血性鏈球菌和肺炎球菌具有抑制作用。還可以保護由肺炎球菌菌株所致的小鼠感染，可能與其中的原花青素B2對細胞的保護作用有關[13]；同時，金蕎麥中的多酚類和黃酮類物質還具有較強的總抗氧化能力和抗脂質過氧化作用[14-15]。程友斌等[16]對金蕎麥不同提取部位進行抗炎測試研究，發現氯仿和水液為抗炎活性部位，具有顯著的抗炎作用，推測其活性物質可能是中等極性和較大極性類型的物質成分，如黃酮類、多酚類以及萜類等類型的物質，具體的活性物質類型還需進一步研究。金蕎麥具有很好的、廣泛的藥理作用，體現出其巨大的藥用價值，從各研究中可以看出，其藥理作用與其植物體內的黃酮類、酚酸類、萜類等物質有極大關系。在此試驗中可以看出，“黔中金蕎麥”黃酮類物質總含量高于野生金蕎麥，尤其是槲皮素含量較高，可能在藥理作用和療效方面也存在一定的優勢，具有良好的藥用價值，為其作為藥用資源開發利用提供了物質基礎。

黔產的野生金蕎麥含量各不相同，差異較大，質量不穩定，成分總含量低，但丹寨野生金蕎麥總含量顯著高于其他野生金蕎麥，可能和貴州各地區海拔梯度有關，進而影響陽光、水分等吸收，以及土壤、環境等差異，導致植物物質成分的差異，體現出貴州地勢地理環境的多樣性，從而導致植物物質成分的多樣性。而采自黔西和麥坪兩地的“黔中金蕎麥”在此試驗條件下顯示，在總含量上差異不明顯，各成分含量均較高，優于黔產野生金蕎麥，也優于云南與重慶產的野生金蕎麥，且質量穩定，體現出自主選育的“黔中金蕎麥”的優勢、價值和意義。

本試驗建立了以HPLC同時測定“黔中金蕎麥”中原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素4種成分含量的方法，適用于 “黔中金蕎麥”的含量測定，也可用于“黔中金蕎麥”的質量控制。“黔中金蕎麥”活性物質豐富、總黃酮含量高，質量穩定，符合中國藥典和中國獸藥典對金蕎麥的含量測定標準，即表兒茶素含量(C15H14O6)≥0.03%(按干燥品計算)，可為該藥材在臨床的應用奠定物質基礎。“黔中金蕎麥”作為一種高蛋白低纖維、營養豐富的牧草資源，采用本試驗建立的檢測方法明確其內控質量，可大面積示范推廣種植，運用于畜禽養殖具有一定的經濟效益和社會效益。