益生菌發酵對中藥總黃酮與總多糖含量的影響

趙玉潔，鄒 悅，周金羽，甄明哲，潘潤蕾，單琢睿，崔一喆

(黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶 163319)

中草藥不僅有著良好的藥效，且相比于人工合成化學藥物有著更小的毒副作用，少殘留，環保等優點。中藥發酵是將天然藥物(中藥材)經處理后以優選的腸道益生菌菌群中一種或幾種、一株或幾株益生菌作為菌種，利用微生態學、仿生學的方法，通過生物嫁接的方式，對提取的中藥有效成分進行生物學轉化，將中藥的大分子物質，經過微生物轉化成小分子成分，使藥材的性能、治療作用大為改變[1]。常用的益生菌主要有酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳桿菌、雙歧桿菌等。其中枯草芽孢桿菌菌體自身可以合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，發揮消化酶的作用，對植物性碳水化合物有較強的分解能力[2]。乳酸桿菌可以發酵碳水化合物并產生大量乳酸，在自然界分布廣泛，且該類群細菌絕大多數對動物和人無毒、無害，不僅可以加快蛋白質、乳糖和鈣等營養物質的消化吸收，產生多種維生素為機體消化吸收所利用，還可以抑制腸道內腐敗菌、致病菌的繁殖，降低血氨和血中膽固醇的含量[3]，這兩種益生菌均有可能促進中藥使用效率的功能。在之前的實驗中[4]，使用了藿香、半枝蓮、陳皮、甘草這四味中藥對奶牛酮病進行過治療，實驗在此基礎上，采用了枯草芽孢桿菌及乳酸桿菌對這四味藥材發酵提取，并進行有效成分含量測定，以各提取液中總黃酮含量及多糖含量為指標設計實驗，通過對比，分析各提取方式的可行性。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑 實驗所用的半邊蓮、陳皮、藿香、甘草均選購于成都市荷花池中藥材批發市場；植物乳酸桿菌(海博生物技術有限公司，批號20210414)；枯草芽孢桿菌(海博生物技術有限公司，批號20210414)；蘆丁(上海源葉生物科技有限公司，T20 N11Z131674)。

1.2 主要儀器與設備 震蕩培養箱(浙江華源儀器有限公司)；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(上海滬凈醫療器械有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)；DRP-9272型電熱恒溫培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)；V-5000可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)。

1.3 菌種接種 本實驗細菌選用LB肉湯液體培養基接種。取LB培養基2.5 g倒入錐形瓶中，加入100 mL純水溶解，再經高壓滅菌鍋121 ℃，滅菌30 min。滅菌后將培養基倒入兩個試管中，并用試管塞塞好，分別編號1號和2號。待冷卻后接入菌種。

本實驗選用枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌，乳酸桿菌為液體菌種，枯草芽孢桿菌為磁珠吸附式菌種。在無菌操作臺，培養基及各實驗操作儀器經紫外滅菌30 min，操作者經酒精消毒。點燃酒精燈，取1號試管，管口與試管塞經酒精燈外焰滅菌消毒，再取鑷子同樣經過酒精火焰，鑷子冷卻后夾取枯草芽孢桿菌冷凍管中占有菌液的磁珠，放入1號培養基中浸潤，完成接種。再取2號培養基，同樣方式經酒精燈火焰消毒，取一次性接種環蘸取乳酸桿菌菌液，浸入2號培養基中，完成接種。將接菌完畢的1號與2號培養基37 ℃恒溫培養24 h 獲得菌液。

1.4 中藥發酵 將藿香、半枝蓮、陳皮、甘草四味中藥分別使用中藥粉碎機(巴菱200型，編號32594356444)粉碎，過60目篩得到中藥粉劑。將每一種中藥分為枯草芽孢桿菌發酵組，乳酸桿菌發酵組，對照組(不加菌)三組，每組設有三個重復。

1.4.1 接菌發酵 稱取三份藿香均為4 g，分別加入三個錐形瓶中，并標號(藿+枯草，藿+乳酸，藿對照)。三組中均加入40 mL純水，對照組只加水和中藥。在葉思勇等人的研究中[5]，選擇出最佳的發酵條件。枯草組和乳酸組分別準確加入1.6 mL的枯草芽孢桿菌菌液或乳酸桿菌菌液(4%濃度)，混合均勻呈糊狀，接著進行37 ℃、轉速180 r/min搖床培養72 h(3 d)。半枝蓮，陳皮，甘草操作方式同上。中藥發酵液制備完畢后，放入搖床培養3 d。

1.4.2 樣品液制備 中藥粉發酵培養完畢后，將發酵液用紗布過濾，取濾渣，精密稱取3 g，放入圓底燒瓶中，加入250 mL的70%乙醇溶液，80 ℃下冷凝回流1 h 40 min，冷卻后，紗布過濾，取濾液，70%乙醇溶液定容至250 mL，作為樣品液。分裝，4 ℃下冷藏。

1.5 總黃酮含量的測定

1.5.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品13.2 mg，加入60%乙醇溶解并定容至15 mL量瓶中，制得0.528 mg/ml蘆丁對照品溶液。

精密吸取蘆丁對照品溶液0 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL于15 mL離心管中，每管分別加入3 mL、2.5 mL、2 mL、1.5 mL、1 mL的60%乙醇(即：分別定容至3 mL)。每管加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min；再各加1 mL 5%硝酸鋁溶液搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液10 mL搖勻，最后將各管用60%乙醇定容到15 mL。靜置15 min得到對照品提取液。

1.5.2 對照品的測定 根據查閱文獻可知[6]，510 nm波長總黃酮吸光值最大，故將上述各提取液用分光光度計測量吸光度，并計算對應的蘆丁質量濃度，結果見表1。

表1 對照品總黃酮含量測定相關數據Tab 1 Determination related data of total flavonoids content of reference substance

以蘆丁質量濃度(x)為橫坐標，吸光度(y)為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準方程。根據標準曲線換算樣品液中總黃酮濃度，再進一步計算黃酮提取率。得到總黃酮濃度標準曲線：y=21.534x-0.063，R2=0.9923。結果見圖1。

圖1 總黃酮含量標準曲線Fig 1 Standard curve of total flavonoids content

1.5.3 樣品總黃酮含量測定 取1.4.2中制好的樣品液5 mL至10 mL離心管中，再加入5 mL的60%乙醇溶液(稀釋2倍)。另取4個10 mL離心管加入稀釋液1 mL，其中一份加入60%乙醇4.6 mL，作為參比溶液，另外三份為均為測量溶液。

1.5.3.1 樣品液總黃酮提取 三份測量溶液中各加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min；再各加0.3 mL的10%硝酸鋁溶液搖勻，靜置6 min；再各加4 mL的10%氫氧化鈉溶液搖勻，靜置15 min。

1.5.3.2 樣品液總黃酮測定 510 nm處，由分光光度計測量三份測量溶液的吸光度，并取其平均值，帶入回歸方程得濃度數據，再根據公式計算其總黃酮含量。

1.5.3.3 樣品總黃酮濃度計算 已知方程：樣品總黃酮含量(mg/g)=X*n*V1/(V*W)

式中：X—測出的濃度(mg/mL)

n—稀釋倍數

V1—樣液總體積(mL)

V—測定時取樣體積(mL)

W—樣品質量(g)

由上述標準方程求得提取液中總黃酮濃度，再由總黃酮含量(mg/g)計算公式求得提取液總黃酮含量。

1.6 總多糖的測定

1.6.1 標準曲線的繪制 稱取4 mg干燥恒重的無水葡萄糖，溶解于40 mL蒸餾水中得到0.1 mg/ml葡萄糖溶液。

精密量取葡萄糖對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別放置于5支10 mL離心管中，分別精密加入純水(1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL、1.0 mL)，定容至2 mL。各加入4%苯酚溶液1 mL搖勻，再加入7 mL濃硫酸搖勻，40 ℃恒溫水浴30 min，再至冷水浴5 min。取提液2 mL至離心管，再加入70%乙醇溶液2 mL稀釋兩倍搖勻，倒入5 mL比色皿中。

1.6.2 對照品的測定 根據查閱文獻可知[7]，490 nm處多糖吸光值最大，故在490 nm處測定對照品各提取液的吸光度并記錄。結果如表2。

表2 葡萄糖對照品總多糖含量的測定Tab 2 Determination of total polysaccharide content of glucose reference substance

以490 nm處多糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，計算標準方程。根據標準曲線換算樣品液中總多糖濃度，再進一步計算多糖提取率。得到總多糖濃度標準曲線：y=81.55x+0.3243，R2=0.9878。結果如圖2。

圖2 總多糖濃度標準曲線Fig 2 Standard curve of total polysaccharide concentration

1.6.3 樣品總多糖含量測定 取1.4.2中制備好的樣品液3份各2 mL，分別加入4%苯酚1 mL搖勻，再加入濃硫酸7 mL搖勻，40 ℃恒溫水浴30 min，后冷水浴5 min。取提液2 mL，再加入2 mL的70%乙醇溶液稀釋2倍搖勻，加入5 mL比色皿。在490 nm處測定其吸光度，帶入標準曲線得其濃度數據，三次結果取平均值，根據公式換算成總多糖含量。

已知方程：W=(C*V1*n)/M*V2

式中：W—可溶性總多糖含量(mg/g)

C—標準方程求得的糖量

V1—提取液量

n—稀釋倍數

V2—吸取樣品液體積

M—樣品重量

由上述標準方程求得樣品多糖濃度，并帶入多糖含量計算公式求得樣品液可溶性總多糖含量。

2 結 果

在510 nm處測得樣品總黃酮吸光度范圍：0.037～0.91，而上述黃酮標準曲線線性范圍：-0.12～1.11，故實驗測得各提取液吸光度均在該范圍內，則可由總黃酮含量公式計算出樣品總黃酮含量，最終測量結果如表3。

在490 nm處測得樣品總多糖吸光度范圍：0.12～1.217，其中藿香水提液、半枝蓮乳酸桿菌提取液、半枝蓮水提液、陳皮三種提取液、甘草乳酸桿菌提取液測得的吸光度符合標準曲線要求，其余提液因數值過小無法記錄，推測由于實驗稀釋倍數過高導致吸光度過小無法計算。每組實驗重復三次，測得SD值，精密度良好。最終測量結果如表3。

表3 樣品有效成分測量情況Tab 3 Measurement of active ingredients of samples

發酵液低于水提液提取量：半枝蓮、陳皮、甘草三味藥材經枯草芽孢桿菌及乳酸桿菌發酵后提取和藿香枯草芽孢桿菌發酵提取出的總黃酮含量低于它們的水提液提取量，其中陳皮的兩組菌發酵液減幅最大，藿香枯草芽孢桿菌發酵液減幅微弱，半枝蓮、甘草的兩組菌發酵液都有明顯減幅；陳皮乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌發酵提取液的總多糖含量也低于其水提液含量，其中陳皮枯草芽孢桿菌發酵液的總多糖含量減幅最大。

發酵液高于水提液提取量：藿香乳酸桿菌發酵液的總黃酮含量微高于其水提液中總黃酮量；半枝蓮、甘草的乳酸桿菌發酵液中總多糖含量明顯高于其水提液中總多糖量。

枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌發酵情況對比：枯草芽孢桿菌對藿香、半枝蓮、陳皮、甘草四味藥材的有效成分提取均有抑制作用，即：枯草芽孢桿菌更容易抑制上述藥材有效成分的釋放；乳酸桿菌僅對半枝蓮、陳皮、甘草三味藥材的總黃酮提取及陳皮總多糖提取產生明顯的抑制作用，而對半枝蓮、甘草的多糖提取都產生明顯促進作用，故乳酸桿菌可能更利于部分藥材的多糖釋放。

有效成分提取量的對比：以上四味中藥提取液中陳皮水提液中總黃酮含量最高(95.06 mg/g),陳皮水提液中總多糖含量最高(309.33 mg/g)

3 分析與討論

經分光光度計測量后，部分藥材總多糖提取液得到的吸光度值極小，超出了多糖標準曲線的線性范圍，故未進行計算，因而得出這部分藥材中總多糖含量不高或提取方法未達到最優從而導致藥材不能釋放更多有效成分。

在實驗過程中出現了發酵后有效成分產量低于未發酵產量，多糖含量過低等異常現象，就本實驗而言，作出以下幾點分析：

3.1 藥物本身的原因 對藥材本身而言不是所有中藥都適合微生物發酵，曾有學者對五十多種藥材進行枯草芽孢桿菌發酵實驗[8]，大部分藥材的藥效無顯著變化，苦參等藥材的藥效大大降低，不能否認藥效的降低與發酵中有效成分的減少無關，這也證實了本實驗中經枯草芽孢桿菌發酵后幾味中藥的總黃酮和總多糖含量顯著降低的現象。

中藥本身的有效成分種類豐富，例如陳皮，富含黃酮類成分數十種，陳皮苷含量可占總含量的50%以上[9]，本實驗中陳皮的黃酮，多糖含量均呈現最高，陳皮苷也許由于微生物酶系水解釋放出大量糖類物質，造成多糖含量高的現象[10]；藿香中揮發油、萜類、酮類等作為主要有效成分[11]，而多糖不作為主要成分[12]，所以檢測中液很有可能出現含量極低的現象。因此，檢測不出成分或者含量多也有部分原因是因為該藥物本身含量的問題。

3.2 菌種的種類及濃度的原因 微生物發酵中藥需要注意的條件有很多，包括菌種的篩選，發酵工藝優化等等。微生物酶系種類繁多，因此發酵過程中對中藥材的細胞影響程度不同，不同的酶系可引發的化學反應不同[13]，有的可以有效破壞植物藥細胞壁，利于胞質內有效成分釋放；也有的可以催化形成新的物質，使某些成分發生生物轉化或者破壞其結構，若有效成分因微生物酶系發生結構變化，也可能產生發酵后含量降低的情況。但對具體的微生物發酵機理尚未完全明確，有待進一步研究。

3.3 提取方法和試劑的原因 發酵條件的篩選對發酵工藝的成功與否也起到了至關重要的作用，本次實驗采取乙醇冷凝回流法提取，測量提取液中黃酮及多糖含量，復盤實驗操作有幾點可以優化：

首先是料液比和菌的篩選，由于藥物濃度和種類與菌群生長情況并非呈線性相關，而是存在峰值的，不同濃度中藥對菌的生長和抑制情況不同，因此發酵達到的效果也會不同。王振華，潘康成[14]探究了不同濃度中藥對枯草芽孢桿菌體外生長情況的影響，結果表明其中含藥濃度為1%、0.5%、0.25%和 0.125%的黃芪和0.5%、0.25%、0.125%的紅花對枯草芽孢桿菌表現出明顯的促生長作用，但1%、0.5%、0.25%的木通和1%的川芎對枯草芽孢桿菌有抑制作用，此外，李平蘭[15]，魏林[16]，丁軻[17]等學者也做出相關實驗得出相關結論。

再者選擇合適的提取試劑，例如本實驗用乙醇回流提取，提取后過濾，取濾液測定多糖含量[5]，而多糖溶于水不溶于乙醇，通常采用乙醇沉淀法提取多糖，本實驗乙醇回流過程中很有可能將中藥細胞內含有的多糖沉淀混入濾渣中造成多糖含量極少而難以測量的現象，即乙醇回流法不適用于提取多糖。劉雅雯[18]等學者用不同濃度乙醇，分級沉淀黃芪多糖，得到70%乙醇沉淀的粗多糖含量最高，幾乎是其他梯度的總和，這也不難解釋為何本實驗多味中藥出現多糖含量過低的現象。

4 結 論

枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌發酵后會顯著降低半枝蓮、陳皮、甘草的總黃酮提取量，對藿香的影響不明顯；經乳酸桿菌發酵后，顯著提高半枝蓮，甘草的總多糖提取量；枯草芽孢桿菌幾乎不能促進以上中藥的多糖釋放。

就總黃酮含量而言，藿香、半枝蓮、陳皮、甘草均不適合發酵，乳酸桿菌使藿香總黃酮提取量稍有增加，但效果不明顯，枯草芽孢桿菌會造成上述中藥總黃酮含量下降；就總多糖含量而言，甘草適合用乳酸桿菌發酵，藿香、半枝蓮、陳皮不適合發酵，會造成總多糖含量下降。

綜上所述，甘草適合進行乳酸桿菌的發酵，可以提高總多糖的含量；藿香、半枝蓮、陳皮不適合發酵，會造成有效成分含量下降或無影響。