雙盾木的快速繁殖技術研究

賈 越，樊思羽，汪銘溥，張李平，吉文麗

（西北農林科技大學，陜西 楊凌 712199）

雙盾木（Dipeltafloripunda）屬隸屬忍冬科雙盾木屬，北溫帶植物區系中的古老、孑遺的木本屬之一[1]。聚傘花序、花鐘狀粉紅色，在陜西省寶雞地區花期為4月初至4月中旬，花期約10 d；花后一對苞片增大呈盾牌狀，十分奇特，是難得的園林觀賞植物，1996年被寶雞市植物園引種后其每年開花，但果實干癟無種仁，播種繁殖無望[2]。

目前有關雙盾木的文獻中，除扦插、葉綠體基因組分析與遺傳多樣性的ISSR分析外，有關其再生繁殖方面的研究在國內尚屬空白。通過實驗，旨在探究雙盾木快繁技術各個階段所需最適培養基，以構建雙盾木組織培養的繁殖技術體系為基礎，為忍冬科雙盾木屬其他植物的快速繁殖技術提供案例與借鑒意義；同時還能為秦嶺植物的引種馴化作出貢獻，豐富陜西地區鄉土植物景觀；并且在總體上增加園林觀賞植物種類的多樣性，提升我國園林生態城市水平。

1 實驗材料與條件

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

MS粉、無水乙醇、NaClO、NAA、6-BA、2，4-D、無菌水、瓊脂和蔗糖。

1.1.2 實驗器材

電磁爐鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、玻璃瓶、玻璃棒、量筒、電子天平、超凈工作臺、鑷子、解剖刀、電熱滅菌器、培養架和日光燈。

1.1.3 植物材料

西北農林科技大學博覽園內有3株從秦嶺引種繁殖的雙盾木植株，外植體材料均采集于此，主要選用幼嫩帶芽莖段部位和葉片來進行組織培養。

1.2 實驗條件

1.2.1 外植體采集條件

外植體采集時應選擇晴朗無云的天氣，上午9—11點或下午3—4點2個時間段為宜，可降低材料的污染率，提高誘導的成功率。

1.2.2 培養基的配置

（1）MS培養基的制作。在實驗過程中，誘導雙盾木愈傷組織產生的培養基采用：MS粉（4.43 g/L）+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，按照所需配量加入激素原液。

（2）植物生長調節劑的配置。6-BA原液：1 mg/mL（需加入少量NaOH將其溶解，再用無菌水進行定容）；NAA原液：1 mg/mL（需加入少量鹽酸將其溶解，再用無菌水進行定容）；2，4-D原液：1 mg/mL。

（3）培養基的配置。選用MS作為基礎培養基，在此基礎上，加入激素6-BA、NAA及2，4-D，并調節pH在5.8~6.0，完成后分裝至培養瓶即可。

2 實驗方法及參數選擇

2.1 初代培養

2.1.1 嫩芽的處理與培養

（1）處理方法。采取的嫩芽用軟毛刷輕輕刷去表面灰塵，清水沖洗干凈之后用無菌水沖洗3~5遍。

（2）消毒。在無菌室內的超凈工作臺上，將處理過的嫩芽先用75%酒精浸泡1 min，后以無菌水沖洗2~3遍；接著用10%的NaClO浸泡10~25 min，再用無菌水沖洗2~3遍，最后用無菌濾紙吸干表面水分。剝去一層外皮后接種于誘導培養基上。

為了確定最佳消毒時間，實驗按照15、20、25 min 3個時間梯度進行消毒，每個梯度接種10瓶，每瓶接種1個外植體，共計30瓶。培養基添加MS粉（4.43 g/L），瓊脂（7 g/L），蔗糖（3 g/L），NAA，6-BA，pH 5.8~6.0。

（3）激素含量梯度實驗。針對最適誘導的激素梯度進行實驗。選用NAA和6-BA作為實驗激素，NAA分為0.05、0.1、0.2 mg/L這3個梯度，6-BA分為0.5、1.0 mg/L這2個梯度，對其進行交叉實驗，每組接種15瓶，每瓶接種3個外植體。

2.1.2 葉片的處理與培養

（1）處理方法。采取的葉片先用軟毛刷輕輕刷去表面灰塵，用清水沖洗干凈，重點清洗葉脈及葉片基部，最后用無菌水沖洗3~5遍。

（2）消毒方法。將葉片切成4 mm×4 mm左右的小塊，用75%酒精浸泡1 min后用無菌水沖洗2~3遍，接著用不同含量的NaClO溶液浸泡10~25 min，再用無菌水沖洗2~3遍，最后用無菌濾紙吸干表面水分，接種于誘導培養基上。

為了確定含量和時間，我們將NaClO含量分為10%、15%、18%、20%4個梯度，將消毒時間分為10、15、20、25 min 4個消毒時間梯度，每個梯度接種10瓶，每瓶接種2~3個葉片，共計120瓶。培養基添加MS粉（4.43 g/L）、瓊脂（7 g/L）、蔗糖（3 g/L）、2，4-D、6-BA并將pH調節至5.8~6.0。

（3）激素選擇。愈傷組織的分化與再生是植物實現由細胞到植株的過程。查閱雙盾木同科植物組織培養文獻后，選定激素6-BA和2，4-D進行誘導實驗。

2.2 繼代培養

在初代培養的基礎上，獲得的愈傷組織數量有限，不能充分發揮組織培養快速繁殖的優勢，所以需要根據初代培養中影響雙盾木培養的主要因素，合理選擇繼代培養基組合，以獲得大量增殖的材料。

實驗選定6-BA和NAA作為調控愈傷組織增殖的生長類激素，給6-BA設置1.0、1.5、2.0mg/L3個梯度；同時給NAA設置0.2、0.4 mg/L共2個梯度。

3 討論與結論

3.1 消毒方法

根據上述實驗中不同的消毒時間、NaCIO含量等參數選擇得出表1和表2數據。

表1 不同消毒時間嫩芽接種效果（污染率）比較

表2 愈傷形成情況

而不同葉片消毒時間和NaClO含量的對應關系見表3。

表3 不同消毒時間、NaClO含量葉片接種效果（污染率）比較

由此得出結論：雙盾木嫩芽最佳滅菌方式為75%酒精處理60 s后用無菌水沖洗3~5遍，接著用10% Na－ClO溶液處理15 min，剝去外葉片接入培養基，平均污染率最低可控制到2%；嫩葉最佳滅菌方式為75%酒精處理60 s后用無菌水沖洗3~5遍，接著用20%NaClO溶液處理15 min。

3.2 初代培養

根據不同的激素含量可得到表4中對應的實驗數據，可以看到：當NAA為0.2 mg/L、6-BA為1.0mg/L時，愈傷組織誘導率最高。

表4 嫩芽初代培養實驗結果

由此得出結論：嫩芽最適培養基配方組合為MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，愈傷組織誘導率達86%。

3.3 繼代培養

按照2.2小節中不同梯度參數進行交叉實驗，可得到表5中繼代增殖培養實驗數據。

表5 繼代增殖培養實驗結果

由此得出結論：愈傷組織適宜的繼代培養基組合為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖倍數達到1.292，且生長率較高，達到44.4%。其他幾組培養基雖也有增殖效果，但是增殖倍數均小于1.292，無不定芽發生。

4 建議與展望

在植物組織培養技術被廣泛運用的今天，作者認為通過組織培養技術實現雙盾木的大量繁殖存在廣闊的進步空間，以及深入研究和推廣的價值。結合實驗，作者對雙盾木組織培養的研究提出以下幾點建議，希望這項研究在今后可以取得突破性進展。

（1）選取外植體時，以幼嫩植物器官為主，越幼嫩的植物器官細胞活性越強，實驗也越容易成功[3]。同樣是4 mm×4 mm的葉片，剛生長出的嫩葉比半成熟葉片的出愈率高，未展葉嫩芽出愈率高于展葉嫩芽。

（2）合理確定消毒時間。一般的原則是莖大于葉大于芽，成熟器官大于幼嫩器官[4]。實驗中，嫩葉與嫩芽消毒時間一致的情況下，嫩葉所需消毒溶液含量是嫩芽的2倍。

（3）外植體消毒過后再進行實驗時，應剝掉最外層表皮；選用嫩芽做外植體時，在接種過程中要剝除最外層包被葉片。

（4）在培養出愈傷組織后，可以直接進行生根培養，免去生成不定芽的步驟，縮短試驗周期[5]。推薦使用當年生枝，更容易生成愈傷組織；若遇到雙盾木休眠期，可以從休眠植株上剪下有芽新枝在溫室進行水培。