勃起功能障礙患者海綿體CYS/H2S通路相關基因表達及其影響機制研究

賀 臘 李毓龍 余松川

四川省簡陽市人民醫院檢驗科（四川 簡陽 641400）

勃起功能障礙(ED)的特征是在性活動期間無法實現或維持足夠的勃起硬度來完成滿意性生活[1]，往往伴有高血壓、冠狀動脈粥樣硬化和糖尿病等[2]。估計到2025年全球將有3.22 億男性患有ED[3]。海綿體內皮參與海綿體平滑肌細胞松弛這一生理現象，有助于勃起功能的啟動和維持[4]。H2S（硫化氫）信號已被證實參與勃起生理學反應，并且在動物實驗中被證明可松弛海綿體并增強其勃起功能[5]。H2S 由CYS（半胱氨酸）通過胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚β-合酶(CBS)的酶活性內源形成，這兩種酶已被發現在人陰莖海綿體和血管中功能性表達[6]。最近，有研究證明H2S 及CYS能通過涉及cGMP 積累的機制松弛勃起功能障礙患者的陰莖海綿體和陰莖動脈[7]。陰莖平滑肌松弛通路的改變會阻礙與勃起有關的血流動力學過程并導致ED，ED的常規治療涉及通過抑制5 型磷酸二酯酶(PDE5) 來增強NO/cGMP 途徑，但存在部分患者對這種治療策略沒有反應。筆者就此進行研究，探究勃起功能障礙患者海綿體CYS/H2SmRNA 表達及其影響機制，旨在為此類患者治療尋找新靶點提供一定依據，現報道如下。

材料與方法

一、材料

樣本來源 研究樣本來自我院2016年-2021年無勃起功能障礙陰莖延長術患者24例（對照組）及同期接受陰莖假體植入患者24例（研究組），患者及其家屬均知情并同意參與研究，本研究經我院醫學倫理委員會批準，簡醫倫審2021029，取患者陰莖組織，保存在4-6°C的滅菌M-400 溶液中（每100 毫升的組成：甘露醇，4.19 克；KH2PO4，0.205 克；K2HPO4·3H2O，0.97 克；KCl，0.112 克；NaHCO2，0.07.08 克）待測。

主要試劑 免疫熒光染色試劑盒（南京凱根生物科技有限公司）；酶聯免疫吸附試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；山羊抗小鼠β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-3一抗購自北京百奧萊博科技有限公司等。

主要儀器 DM 750 型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Spectra Max M5型多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；RM2235 型石蠟切片機（德國Leica公司）；定量PCR 儀器（賽默飛世爾科技）；全自動免疫分析儀（美國雅培制藥）等。

二、方法

（一）海綿體組織（human corpus cavernosum，HCC）的功能評價

將海綿體組織條帶(3×3×7 mm) 浸入8 mL 含有Krebs-Henseleit 溶液的器官室中，該溶液由以下成分(mM) 組成：NaCl 119、KCl 4.6、CaCl2 1.5、MgCl2 1.2、NaHCO324.9、葡萄糖 11，KH2PO4 1.2，EDTA 0.027；在37℃下用95%O2/5%CO2混合物連續鼓泡以保持pH值為7.4，用于如前所述的等長張力記錄（MartínezSalamanca 等人，2015 年；La Fuente 等人，2019 年）。1 μM去氧腎上腺素(PE)的最大收縮反應下降每個組織條逐漸拉伸到最佳等長張力。然后將制劑暴露于高K+濃度(125 mM)并測量收縮反應，并通過觀察NaHS 或CYS表達來評估松弛反應。

（二）蛋白質印跡分析

從HCC 中提取總蛋白質樣品。HCC 組織用預冷的組織裂解液勻漿，4℃12,000 rpm 離心15 分鐘，取上清液。使用BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。將等濃度的蛋白質裂解物加載到10%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳上，電泳80 V 30 分鐘和120 V 60 分鐘，然后電轉移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1h。然后，將膜與CaSR、PLC、PKCδ、JNK，p38，Bax，GAPDH 抗體 4℃過夜，然后清洗膜并與適當的辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育1 小時。最后使用增強型化學發光檢測系統（Clinx Science Instruments, U.S.A.）觀察蛋白質條帶。測量β-actin 表達水平作為內源參考并用于標準化。根據 2-ΔΔCt方法計算相對表達。

（三）cGMP含量的測定

使用NaHS(1 mM)或CYS(1 mM)5 分鐘后，立即將HCC 條浸入液氮中冷凍并儲存在-80°C 直至提取環核苷酸。組織在6 次均質中提取%三氯乙酸，然后用乙醚（H2O 飽和）萃取并凍干。使用ayman Chemical Company 的試劑盒，通過酶聯免疫吸附測定法測定cGMP 的濃度，試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

（四）免疫熒光檢測

將 HCC 浸入蔗糖（30% w/v）中，嵌入包埋劑（optimum cutting temperature，OCT）中并儲存在-80°C下。OCT 塊在低溫恒溫器中切片。用丙酮處理去除OCT，用含有 2%BSA 的 PBS 封閉 30 分鐘，然后與兔抗體抗人CBS（1∶200 稀釋）和 CSE（1∶100 稀釋）在4°C 下孵育過夜。PBS 洗滌后，將切片與二級Alexa Fluor 488 偶聯山羊抗兔抗體孵育45 分鐘在室溫下和300 nM 二脒基-2-苯基吲哚在室溫下復染細胞核5 分鐘。切片安裝并通過熒光顯微鏡觀察。

（五）CYS、H2S水平檢測

取 HCC 組織制成勻漿，3000r/min 離心 20min，取上清液，使用酶聯免疫吸附試驗檢測。試劑盒分別為CYS Elisa檢測試劑盒，購自默克生物；H2S Elisa檢測試劑盒購自武漢塞培生物。

三、統計學方法

結 果

一、ED患者CYS/H2S 通路受損

研究組患者HCC 組織中CYS、H2S 水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 兩組CYS、H2S水平比較()

二、ED與人海綿體對CYS/H2S 通路介導的松弛反應降低有關

研究組患者HCC 中NaHS及CYS的 pEC50、Emax顯著降低（P＜0.05），NaHS 的Emax無顯著變化（P＞0.05）。ED 與CYS、NaHS 誘導的HCC 松弛反應降低顯著相關見表1，圖2。

表1 兩組pEC50、Emax比較（）圖中第二條橫線中間

表1 兩組pEC50、Emax比較（）圖中第二條橫線中間

組別對照組（n=24）研究組（n=24）CYS NaHS t P pEC50 4.92±0.25 3.83±0.19 17.006 0.000 Emax（%）68.04±5.53 47.18±4.26 14.640 0.000 pEC50 4.84±0.21 4.07±0.16 14.288 0.000 Emax（%）95.25±8.04 87.57±7.55 3.411 0.001

圖2 相關性分析曲線

三、ED患者的HCC中CYS及NaHS產生cGMP的能力降低

研究組患者HCC中CYS及NaHS誘導的cGMP表達顯著低于對照組（P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組產生cGMP能力比較（）

四、ED患者Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達變化

研究組患者HCC中Bax、Caspase-3蛋白相對表達顯著高于對照組，Bcl-2蛋白相對表達顯著低于對照組（P＜0.05），見（圖4a和圖4b)。

圖4 兩組Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達

五、ED 患者 HCC 中 H2S 合成酶 CSE 和 CBS 表達降低

免疫熒光檢測結果顯示，相較對照組，研究組HCC中CSE和CBS表達減少。見圖5。

圖5 兩組免疫熒光檢測結果

討 論

近年來，ED 發病率呈現逐年上升趨勢，嚴重影響男性身心健康。盡管目前已有包括基因治療、干細胞移植、5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑和低能量沖擊波治療ED新途徑[8]。然而ED發病機制尚未闡明，仍有部分患者療效不夠理想。最近有研究報道了通過對來自ED患者陰莖組織外源性添加穩定的H2S 類似物(NaHS)或CYS促H2S產生導致HCC)松弛和陰莖動脈(HPRA)的血管舒張[9-10]。進一步證實了CYS/H2S 通路驅動陰莖血管組織松弛的能力。

本研究創新性在于，筆者發現ED 患者病情發生發展與其HCC 和HPRA 中CYS/H2S 信號傳導受損具有密切聯系。從這個意義上說，ED 中CYS/H2S 途徑的主要改變是由內源性H2S 產生介導的功能反應受損。事實上，NaHS 誘導的松弛在HCC 中受到ED 的輕度損害，由CYS 誘導的松弛/血管舒張顯然比由外源性添加的H2S 類似物誘導的反應更受ED 的影響。Aydinoglu 等[11-12]發現用氨氧乙酸和炔丙基甘氨酸抑制H2S 合成酶會減弱CYS 在小鼠和人類陰莖組織中的松弛能力，證實CYS 誘導的松弛需要內源性產生H2S。此外，本研究也顯示來自ED 患者的HCC中CYS 誘導的松弛顯著減少，與其結果基本相符。cGMP 信號在人類和動物陰莖組織以及其他組織中的參與勃起功能調節[13]。人陰莖組織中與ED 相關的CYS/H2S 通路的功能障礙與CYS 誘導ED 患者HCC 中cGMP 積累的能力顯著降低一致。分析cGMP 測定表明ED 患者的海綿體組織中H2S 的產生功能失調，而不是該氣體遞質刺激cGMP 積累的功效降低，因為未檢測到NaHS增加這些組織中cGMP 的能力顯著降低。H2S 還是一種細胞凋亡調控因子，有研究指出其可通過抑制caspase-3表達提高細胞活性，減少細胞凋亡[14]。但其是否參與海綿體細胞損傷引起ED 尚未得到證實。細胞凋亡是維持細胞環境動態平衡的基本程序性細胞死亡過程。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax組成。Bcl-2 是著名的具有代表性的凋亡抑制因子，而Bax 可以與Bcl-2 結合形成異源二聚體，拮抗Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用，促進細胞凋亡。另一方面，Bax 還激活caspase-3，促進Ca2+釋放，進而導致細胞凋亡。Caspase-3 作為代表性的執行者在細胞凋亡中起著舉足輕重的作用。因此，Bax、Bcl-2和caspase-3水平被認為是評價細胞凋亡的指標。本研究結果可見，研究組患者HCC 中Bax、Caspase-3 蛋白相對表達顯著高于對照組，Bcl-2 蛋白相對表達顯著低于對照組（P＜0.05）。提示ED 患者CYS/H2S 通路損傷可能引起ED。

此外，在內皮動脈平滑肌中均檢測到CBS 和CSE的表達。然而，Aydinoglu 等[15]指出在小鼠海綿體中，H2S 產生CYS 具內皮依賴性。雖然最初認為H2S 僅由血管平滑肌細胞合成，但后來證明它也可以由內皮細胞產生，并在內皮血管舒張中起重要作用[16]。蛋白質硫化被認為是內源性硫化氫對內皮功能影響的機制，無論精確的分子機制如何，目前的結果都與內皮功能和內源性硫化氫生成的血管舒張能力之間的聯系一致，本研究中 ED 與 CYS、NaHS 誘導的 HCC 松弛反應降低顯著相關這一結果也對其進行了證實。ED 患者海綿體組織中兩種主要H2S 合成酶表達的顯著降低可以解釋與健康組織相比，這些組織中CYS/H2S 通路的功能受損。免疫熒光檢測顯示ED患者的HCC中CBS和CSE表達均顯著降低，這表明CYS誘導的陰莖血管組織松弛的缺陷可能是由于CBS和CSE的表達受到抑制。這些酶的表達降低會導致暴露于CYS后H2S的可用性降低，cGMP 積累減少，從而導致 ED 患者 HCC 松弛減弱。

本研究不足：盡管根據目前的數據，以上推論及分級是合理的，但應該注意的是，本研究報告的CYS 誘導的松弛受損與CBS 和CSE 下調之間的關系僅具有關聯性，缺乏操縱酶表達的因果證據。目前數據的另一個不足是缺乏海綿體組織中H2S 測量，此外，現在人們普遍認為，H2S 的產生會導致心血管疾病的血管功能障礙[17]，從這個意義上說，在高血壓動物模型中已經報道了CBS和CSE血管表達降低。此外，導致CBS或CSE表達降低的小鼠基因敲除已被證明會導致內皮依賴性松弛缺陷和血壓升高，同時，在患有ED 的糖尿病大鼠的海綿體組織中，觀察到CBS 和CSE 表達但活性較低[18-19]，但需要進一步證實其在人體組織中變化趨勢及作用機制，為進一步研究提供基礎。

綜上所述，ED患者的海綿體組織和陰莖動脈顯示出受損的CYS/H2S 介導的海綿體平滑肌松弛和cGMP積累，這與這些組織中H2S合成酶、CBS和CSE的表達降低有關，其可能通過影響患者正常海綿體松弛及海綿體細胞凋亡影響患者勃起功能。