施氮對苜蓿初花期光合日變化、葉片形態及干物質產量的影響

孫延亮，趙俊威，劉選帥，李生儀，馬春暉，王旭哲，張前兵

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003）

氮素是植物生長發育所必需的營養元素，植物生長所需要的主要礦物質元素中，氮素占40%以上，且氮素是植物體內核酸、氨基酸和蛋白質等大分子有機氮化合物的重要組成元素，也是植物葉綠素、植物激素、光合酶及維生素的主要成分，因此氮在植物生命活動中具有首要地位，被稱為“生命元素”［1-2］。目前為止，地球上可自由獲得的氮主要來源于大氣中的N2，但是大部分植物依賴其可利用的氮形式（主要為銨鹽和硝酸鹽）來生長，而這些氮基質的可利用性則依賴于不同的氮轉化反應，包括豆科植物的根瘤菌固氮作用，微生物的硝化作用、氨化作用和同化作用。此外，土壤有機物的分解和植物根系分泌物也是氮素輸入的重要部分［3-4］。研究表明，不施氮肥土壤可利用氮的生成不能滿足植物的吸收利用，會造成土壤氮的虧缺，而氮肥的過量施用，則會嚴重擾亂土壤原有的氮素循環，影響土壤生產力，并導致嚴重的環境污染［5］。紫花苜蓿（Medicago sativa）是我國大規模種植的優質牧草植物，因其具有干物質產量高、營養品質好、適應性強等特點，被譽為“牧草之王”［6］。新疆農田土壤普遍缺氮，苜蓿與根瘤菌的共生固氮量又不能滿足植株生長需求，因此外源氮的添加對提高苜蓿干物質產量和產業可持續發展具有不可替代的重要作用［7］。

植物的光合作用是干物質積累和產量形成的基礎，較高的光合面積和光合速率是獲得高產的基礎［8］。葉片是植物進行光合作用的主要場所，其結構和功能與植物光合作用密切相關［9］。研究表明，不同氮素用量對植物葉片形態、光合速率及群體質量影響顯著，施氮可以促進葉面積的增大，進而增加光的捕獲面積［10］；在低氮條件下，群體葉面積相對適宜，植物葉片傾角較小，且基角和開張角表現為下層葉＞中層葉＞上層葉，因此植物能夠獲得更多的光照進行光合作用，最后群體光合生物量積累較高，在高氮條件下，上層葉片葉面積更大且葉片傾角增加，對中下層葉片造成明顯的遮蔭現象，導致中下層葉片光合速率的下降，進而導致群體質量的降低［11］。苜蓿干物質產量還遠未達到其生物學極限，光合作用是構成植物生物量的最主要因素，營養元素的不足被認為是植物光合和生長的潛在限制因素［12］。研究發現，適量的氮添加可以緩解苜蓿生長的氮限制，促進苜蓿葉片的光合作用，但隨著氮肥施用量的增加，氮素添加的正向效應發生了轉移，由于氮的施用量超過了苜蓿生長發育的需要，苜蓿的生長促進作用不會進一步增加，甚至會抑制苜蓿的生長［13］。此外，當土壤水分不足時，施氮量的增加有助于脫落酸（abscisic acid，ABA）的降低，從而促進植物葉片氣孔導度和光合速率的增加［14］。

目前，關于紫花苜蓿光合特性的研究主要集中在品種間的比較以及水分脅迫、高溫脅迫、CO2濃度等環境因子方面，而關于紫花苜蓿葉片形態結構特征與光合日變化關系以及對外界環境的適應性方面的研究較少，尤其是施氮對滴灌苜蓿葉片形態、光合日變化及干物質產量的影響機制鮮見報道。因此，本研究設置了4個施氮水平，對紫花苜蓿光合日變化、葉片形態結構變化及產量構成等指標進行測定，探討不同施氮水平下紫花苜蓿葉片結構和光合特性的變化規律，分析葉片氮含量、葉片形態、光合日變化與干物質產量之間的關系，以期進一步明確施氮對紫花苜蓿干草產量形成的影響機制，進而為優化實際生產中紫花苜蓿的氮管理策略提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于新疆石河子市石河子大學牧草實驗站（44°20′N，86°30′E，海拔420 m），地處天山北麓中段，準噶爾盆地南緣，屬于溫帶大陸性干旱氣候。全年降水稀少，氣候干燥，冬季長而嚴寒，夏季短而炎熱，試驗區以灰漠土為主。土壤耕層（0～20 cm）含有機質21.56 g·kg-1，全氮1.18 g·kg-1，全磷0.53 g·kg-1，速效鉀119.8 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗采用單因素隨機區組設計，設置4個施氮水平，分別為施氮肥：0（CK）、60（N1）、120（N2）和180 kg·hm-2（N3），重復3次，共12個小區。試驗所用氮肥為尿素（含N 46%），通過滴灌系統采用“氮隨水走”的高效節水節肥方式，在苜蓿返青后分枝期及前3茬刈割后3～5 d隨水滴施。

供試紫花苜蓿品種為高產、抗鹽堿、耐低溫的WL366HQ，于2019年進行人工條播，播種量為18 kg·hm-2，播種行距為20 cm，播種深度為2 cm，播前進行土地深翻，為苜蓿根系的深入提供良好環境，播后及時進行鎮壓，有利于種子和土壤的緊密結合以及土壤表層的保墑。滴灌帶淺埋至地表下10 cm，間距為60 cm，所用滴灌帶為內鑲片式滴灌帶，其滴頭間距為20 cm。各小區面積均為24 m2（4 m×6 m），小區四周設置1 m的保護行，防止小區間養分、水分的滲透，田間管理措施除施肥外，其他灌溉、中耕除草、病蟲害防治等管理均按照當地高產苜蓿田統一進行。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 光合特性測定 于紫花苜蓿第二茬初花期期間（2020年6月26日，苜蓿開花5%～10%），采用Li-6400便攜式光合作用測定系統，在晴朗無云的天氣進行田間活體測定，隨機選擇生長良好的苜蓿植株，測定其倒數第3片完全展開的健康完整葉片，測定時間為10：00-20：00，每隔2 h測定1次，每個小區隨機選取6個葉片測定，測定 指 標 包 括 凈 光 合 速 率（net photosynthetic rate，Pn，μmol CO2·m-2·s-1）、胞 間CO2濃 度（intercellular CO2concentration，Ci，μmol·mol-1）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs，cm·s-1）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr，mmol H2O·m-2·s-1）等生理因子，并記錄光合有效輻射（photosynthetically active radiation，PAR，μmol·m-2·s-1）、田間CO2濃 度（field CO2concentration，Ca，μmol·mol-1）、空 氣 相 對 濕 度（relative air humidity，RH，%）、氣 溫（atmospheric temperature，Ta，℃）、葉表飽和蒸汽壓（leaf surface saturated vapor pressure，Vpdl，Kpa）等環境因子。苜蓿葉片的氣孔限制值（stomatal limitation value，Ls）和瞬時水分利用效率（water use efficiency，WUE）分別采用以下公式計算：

1.3.2 葉片性狀 每個小區采集12個葉片（倒數第3片完全展開的健康完整葉片）帶回實驗室，使用掃描儀（EpsonScan V700，日本）獲取葉片的圖像，采用Image Pro Plus軟件對葉長、葉寬和葉面積（leaf area，LA）進行測量；每個小區選12株具有代表性的苜蓿植株，剪取苜蓿全株成熟葉片（未展開葉片和枯黃葉片除外），通過Image Pro Plus軟件測定其總面積，然后烘干稱重，比葉重（specific leaf weight，SLW）通過葉片烘干總重與總面積的比值計算；葉片氮含量采用凱氏定氮法測定。

1.3.3 干物質產量及莖葉比 采用樣方法測定，在光合測定結束后隨機選取長勢一致且能夠代表本小區長勢的苜蓿樣方（1 m×1 m）進行刈割，重復3次，留茬5 cm左右，另取400 g左右帶回實驗室，于105℃下殺青30 min后65℃烘干至恒重，計算出苜蓿含水率并進一步折算出苜蓿干物質產量；將烘干后的苜蓿樣品進行莖葉分離，并分別稱重，莖葉比通過莖稈的重量和葉片的重量的比值計算。

1.3.4 光合產物測定 將烘干粉碎后的全株苜蓿樣品通過蒽酮比色法對淀粉和可溶性糖含量進行測定［15］。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2016整理試驗數據，采用SPSS 22（SPSS Inc.，美國）進行方差分析、數據的z-score標準化，采用Origin Pro 2021（Origin Lab，美國）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和繪圖，采用Image Pro Plus 6.1（Media Cybernetics，美國）對掃描苜蓿葉片獲得的圖像進行葉長、葉寬、葉面積的測量；采用IBM SPSS AMOS 24（SPSS Inc.，美國）進行結構方程模型的計算，分析主要環境因子與凈光合速率和蒸騰速率的關系，以及葉片氮含量、主要光合性能和葉片形態指標與干物質產量的關系，采用多個模型適配性參數對模型進行合理的評價，主要包括卡方值與自由度之比小于3、顯著性概率值大于0.05、近似誤差平方根小于0.1、比較模型指數大于0.9、Tucker-Lewis指數大于0.9、擬合優度指數大于0.9、規范擬合指數大于0.9，當模型符合各個評價指標的標準時，說明該模型適配度較好。采用Microsoft PowerPoint 2016進行結構方程模型的繪制。

2 結果與分析

2.1 田間環境因子日變化

在10：00-20：00，光合有效輻射（PAR）日變化呈“單峰”曲線，從10：00開始，隨著時間的推移，PAR逐漸增加，至14：00時達到最大值，之后逐漸下降，至20：00達到最低值（圖1）。田間CO2濃度（Ca）的變化規律為“V”型，早上10：00為最大值，隨后緩慢下降，在16：00降至最低值，隨后又逐漸回升。在光合日變化測定期間，空氣相對濕度（RH）的變化幅度為12.85%～28.95%，在10：00左右時為最高，此后隨著溫度的迅速升高而快速下降，在16：00降至最低值，之后隨著大氣溫度的降低又有所回升。大氣溫度（Ta）在一天當中為10：00最低，此后隨著光合有效輻射的增加而逐漸升高，在16：00達到最高點，為41.05℃，其峰值相對PAR略有滯后，之后隨著光合有效輻射的降低而緩慢下降。葉表飽和蒸汽壓（Vpd）l的變化規律和Ta的變化趨勢一致。

圖1 田間環境因子日變化Fig.1 Daily variation of environmental factors in the field

2.2 不同施氮水平對苜蓿葉片光合日變化的影響

2.2.1 紫花苜蓿葉片凈光合速率日變化特征 施氮處理（N1、N2、N3處理）凈光合速率（Pn）日均值均極顯著大于不施氮處理（P＜0.01），不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片凈光合速率日變化趨勢均呈典型的“雙峰”曲線（圖2），光合測定期間，N2處理的Pn均高于其他處理，上午10：00-12：00呈快速上升趨勢，12：00出現第一峰值，且為全天最大值，隨后在14：00各處理紫花苜蓿均出現不同程度的“光合午休”，隨后又呈上升趨勢，在16：00左右出現第二峰值，此后又緩慢下降，至20：00降至一天中最低值。各處理紫花苜蓿的日平均凈光合速率N2處理最高，其次分別為N3、N1、CK處理（圖3a）。

圖2 不同施氮水平下苜蓿葉片凈光合速率日變化Fig.2 Daily variation of net photosynthetic rate of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.2.2 紫花苜蓿葉片蒸騰速率日變化特征 不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片蒸騰速率（Tr）日變化進程與凈光合速率基本一致，均為不對稱“雙峰”曲線，但其峰值出現時間相對凈光合速率滯后2 h左右（圖4）。光合測定期間，N2處理的Tr均高于其他處理，上午10：00-14：00呈快速上升趨勢，14：00出現第一峰值，且為全天最大值，隨后在16：00時各個處理均處在谷底，第二峰值出現在18：00左右，此后Tr急速下降，至20：00達到一天中最低值。各處理紫花苜蓿的日平均蒸騰速率由大到小的順序依次為N2＞N3＞N1＞CK處理，且N2、N3處理之間差異不顯著，但施氮處理均顯著大于不施氮處理（P＜0.05）（圖3b）。

圖3 不同施氮水平下苜蓿葉片光合參數日均值Fig.3 Daily average values of photosynthetic parameters of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

圖4 不同施氮水平下苜蓿葉片蒸騰速率日變化Fig.4 Daily variation of transpiration rate of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.2.3 紫花苜蓿葉片胞間CO2濃度日變化特征 不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片胞間CO2濃度（Ci）日變化進程呈現“V”型的變化（圖5），上午10：00為全天的最大值，隨著時間的推移，苜蓿葉片Ci逐漸下降，在14：00達到一天中最低值，此后，在20：00又快速回升至“V”型另一個高點。各處理紫花苜蓿的日平均Ci中N2處理最低，其次分別為N3、N1、CK處理且施氮處理均顯著小于不施氮處理（P＜0.05）（圖3c）。

圖5 不同施氮水平下苜蓿葉片胞間CO2濃度日變化Fig.5 Daily variation of intercellular CO2 concentration in alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.2.4 紫花苜蓿葉片氣孔限制值日變化特征 不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片氣孔限制值（Ls）日變化進程呈現“倒V”型的變化趨勢，整體變化規律與胞間CO2濃度相反（圖6）。上午10：00和下午20：00為氣孔限制值較低的兩個時間點，由于溫度的升高，上午10：00-14：00為快速增長階段，14：00到達全天最大值，隨后緩慢降低。其中施氮處理紫花苜蓿的日平均氣孔限制值均顯著大于不施氮處理（圖3d）。

圖6 不同施氮水平下苜蓿葉片氣孔限制值日變化Fig.6 Daily variation of stomatal limitation value of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.2 .5紫花苜蓿葉片水分利用效率日變化特征

不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片水分利用效率（WUE）日變化進程均呈不對稱“雙峰”曲線（圖7），苜蓿葉片水分利用效率在上午的10：00-12：00為一天中最高的時段，其中12：00出現第一個峰值，隨后快速下降，于14：00達到谷值，這是由于苜蓿“光合午休”導致凈光合速率下降，16：00達到第二個峰值，但第二個峰值明顯低于第一個峰值。各處理紫花苜蓿的日平均水分利用效率由大到小的順序依次為N2＞N3＞N1＞CK處理（圖3e）。

圖7 不同施氮水平下苜蓿葉片水分利用效率日變化Fig.7 Daily variation of water use efficiency of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.3 不同施氮水平對苜蓿葉片形態結構的影響

紫花苜蓿葉面積、葉長、葉寬、比葉重均隨著施氮水平的增加呈先增加后降低的趨勢（表1）。N2處理下紫花苜蓿的葉面積和比葉重顯著高于其他各處理（P＜0.05），N2和N3處理間的葉長和葉寬差異不顯著（P＞0.05），但N2和N3處理均顯著高于CK和N1處理（P＜0.05）。施氮水平對初花期紫花苜蓿葉面積、葉長、葉寬、比葉重均具有極顯著的影響（P＜0.01）。由F值可知，施氮水平對紫花苜蓿葉片形態結構的影響最大的為葉面積，其次為比葉重、葉長和葉寬。

表1 不同施氮水平下苜蓿葉片形態結構變化Table 1 Changes in morphological structure of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.4 不同施氮水平對苜蓿干物質產量構成、光合產物以及葉片氮含量的影響

隨施氮量的增加，紫花苜蓿的干物質產量、葉干重、莖干重、葉片氮含量、淀粉、可溶性糖含量均呈先增加后降低的趨勢，而莖葉比則呈先降低后增加的趨勢（表2）。紫花苜蓿的干物質產量、葉干重、可溶性糖含量為N2處理顯著高于CK和N3處理（P＜0.05），施氮處理間紫花苜蓿的莖干重和莖葉比差異不顯著（P＞0.05），但施氮處理的莖干重顯著大于不施氮處理（P＜0.05），莖葉比顯著小于不施氮處理（P＜0.05），且N2處理的葉片氮含量、淀粉含量顯著大于其他各處理（P＜0.05）。施氮水平對初花期紫花苜蓿干物質產量、葉干重、莖干重、葉片氮含量和淀粉均具有極顯著影響（P＜0.01），對莖葉比和可溶性糖具有顯著影響（P＜0.05）。由F值可知，施氮水平對葉片氮含量影響最大，其次分別為葉干重、干物質產量、淀粉、莖干重、可溶性糖、莖葉比。

表2 不同施氮水平下苜蓿干物質產量構成、光合產物和葉片氮含量Table 2 Dry matter yield components，photosynthetic products and nitrogen content of leaves of alfalfa at different nitrogen application levels

2.5 不同施氮水平下紫花苜蓿干物質產量、葉片形態以及光合作用的主成分分析及綜合評價

通過主成分分析對不同施氮水平下苜蓿干物質產量、葉片形態以及光合作用進行綜合評價（圖8），綜合特征值大于1且累計方差貢獻率大于90%來確定最佳的主成分數。結果表明，第1主成分對總方差貢獻率達89.5%，其中比葉重、干物質產量、葉面積、葉寬、葉片氮含量、凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、水分利用率貢獻較大，第2主成分對總方差貢獻率達8.0%，其中可溶性糖和淀粉貢獻較大，而比葉重貢獻最小，主成分1和主成分2累計貢獻率達到97.5%，可以代表紫花苜蓿干物質產量、葉片形態以及光合作用的絕大部分信息。不同處理下，第1主成分得分由高到低依次為N2＞N3＞N1＞CK處理，第2主成分得分由高到低依次為N1＞N2＞CK＞N3處理，綜合主成分1和2可知，不同施氮處理下干物質產量、葉片形態以及光合作用綜合得分最高的為N2處理，其次分別為N3、N1和CK處理。

圖8 不同施氮水平下苜蓿干物質產量、葉片形態以及光合作用的主成分分析Fig.8 Principal component analysis of dry matter yield，leaf morphology and photosynthesis of alfalfa under different levels of nitrogen application

2.6 基于結構方程模型綜合分析主要環境因子與凈光合速率和蒸騰速率的關系

4個環境因子共解釋了凈光合速率84%的差異，通過標準化影響柱狀圖可以發現（圖9），葉表飽和蒸汽壓（rd=-0.31，rd：直接回歸權重系數）對凈光合速率有直接影響；空氣相對濕度直接（rd=0.33）和間接（ri=0.26，ri：間接回歸權重系數）通過葉表飽和蒸汽壓影響凈光合速率；光合有效輻射直接（rd=0.96）或間接（ri=-0.23）通過空氣相對濕度（r=0.01，r：回歸權重系數）、大氣溫度（r=0.54）以及葉表飽和蒸汽壓（r=-0.26）影響凈光合速率；大氣溫度直接（rd=0.03）或間接（ri=-0.61）通過空氣相對濕度（r=-0.90）和葉表飽和蒸汽壓（r=0.01）影響凈光合速率。4個環境因子還解釋了蒸騰速率73%的差異，通過標準化影響柱狀圖可以發現，葉表飽和蒸汽壓（rd=-0.61）對蒸騰速率有直接影響；空氣相對濕度直接（rd=-0.76）和間接（ri=0.51）通過葉表飽和蒸汽壓影響蒸騰速率；光合有效輻射直接（rd=0.67）或間接（ri=0.17）通過空氣相對濕度（r=0.01）、大氣溫度（r=0.54）以及葉表飽和蒸汽壓（r=-0.26）影響蒸騰速率；大氣溫度直接（rd=-0.03）或間接（ri=-0.06）通過空氣相對濕度（r=-0.90）和葉表飽和蒸汽壓（r=0.01）影響蒸騰速率。

圖9 基于結構方程模型綜合分析主要環境因子與凈光合速率和蒸騰速率的關系Fig.9 Integrated analysis of the relationship between major environmental factors and net photosynthetic rate and transpiration rate based on structural equation model

2.7 基于結構方程模型綜合分析葉片氮含量、主要光合性能和葉片形態指標與干物質產量的關系

葉片氮含量、葉面積、比葉重、凈光合速率、蒸騰速率共解釋了干物質產量88%的變異，通過標準化影響柱狀圖可以發現（圖10），凈光合速率（rd=0.60）對干物質產量有直接影響；蒸騰速率直接（rd=-0.02）或間接（ri=0.53）通過凈光合速率（r=0.89）影響干物質產量的形成；葉面積直接（rd=-0.07）或間接（ri=0.59）通過比葉重（r=0.65）和蒸騰速率（r=0.90）影響干物質產量的形成；比葉重直接（rd=0.18）或間接（ri=0.02）通過蒸騰速率（r=0.05）影響干物質產量的形成；葉片氮含量直接（rd=0.30）或間接（ri=0.56）通過葉面積（r=0.84）、比葉重（r=0.27）、凈光合速率（r=0.09）和蒸騰速率（r=0.03）影響干物質產量的形成。

圖10 基于結構方程模型綜合分析葉片氮含量、主要光合性能和葉片形態指標與干物質產量的關系Fig.10 Integrated analysis of leaf nitrogen content，major photosynthetic properties and leaf morphological indicators in relation to dry matter yield based on structural equation model

3 討論

3.1 不同氮素水平對紫花苜蓿干物質產量的影響

土壤氮含量和生物固氮是紫花苜蓿兩個可供選擇的氮獲取策略，外源氮的添加能夠有效地增加土壤氮資源有效性，而土壤氮有效性能夠將苜蓿植株間競爭的壓力從地下轉移到地上，以誘導更多的資源分配到以葉片為主的地上部分［16］。本研究中，苜蓿干物質產量隨著施氮量的增加呈先增加后降低的趨勢，對比不施氮處理，氮添加顯著提高了干物質產量，目前關于苜蓿在種植過程中是否需要額外的氮肥添加或者氮肥添加量的大小以提高其干物質產量這一關鍵問題上仍存在較大爭議，有一部分觀點認為苜蓿可以與根瘤菌共生固氮，將大氣中的氮氣轉化為可以供植物吸收利用的形態以滿足自身植株生長的需要，因此，氮肥的添加并不會對苜蓿的生長有促進作用［17］，也有一部分觀點認為施少量的氮能夠促進苜蓿的生長，在苜蓿生長初期及衰老期苜蓿根瘤菌固氮酶活性較弱，外源氮的添加能夠顯著的提高苜蓿的干物質產量［13］。相反，氮肥的過量施入則會抑制苜蓿的生長發育，過量的氮添加會破壞土壤微環境，土壤本身具有一定的緩沖能力，其所含有的銨態氮和硝態氮在被植物吸收時向土壤釋放的H+和OH-能夠相互中和，當外界添加銨態氮或硝態氮的任意一種就會打破這種平衡［18］，同時，土壤的酸化和堿化并不利于微生物的活動與繁殖，進而影響苜蓿田的生物固氮以及土壤養分平衡和可持續利用能力［19］。對于氮肥添加是否促進或者抑制苜蓿的生長，或是沒有影響，本研究認為，除了可能由上述的根瘤菌固氮、土壤pH值和微生物數量的變化造成的影響外，還可能與苜蓿品種特性、地區間環境差異及土壤基礎養分含量密不可分，因此，施氮對苜蓿干物質產量的作用效果因不同的研究地區而導致研究結果不同。本研究中，對比不施氮處理，施氮處理苜蓿葉片干重增加了7.83%～11.98%，莖稈干重增加了3.6%～6.4%，葉片干重增加幅度更大，說明施氮處理下苜蓿植株會將更多的生物量向葉片分配，同時，本研究中施氮處理莖葉比的下降也能夠反映這一點。

3.2 不同氮素水平對紫花苜蓿光合作用的影響

植物光合作用是維持自身生命活動的主要能量來源，實際光能轉化效率僅為理論值的25%左右，仍有很大的提升空間，進一步地提高光能轉化效率已成為大幅度提高作物干物質產量的重要甚至是唯一可行的途徑［20］。本研究中，在光合日變化測定期間，施氮處理的凈光合速率、蒸騰速率和水分利用效率均高于不施氮處理，這說明施氮能夠促進苜蓿的光合作用。研究表明，葉綠素是植物進行光合作用的重要物質基礎，氮素能夠提高苜蓿葉片的葉綠素含量，并延緩葉片的衰老速度，進而提高苜蓿生長后期的葉片氮含量和凈光合速率［21］，此外，施氮能夠促進葉片柵欄組織和海綿組織的發育，高度發達的柵欄組織既能夠最大限度利用衍射光進行光合作用，又能夠促進葉片水分的高效運輸，并避免葉肉組織被強光照灼燒，而海綿組織的增厚能夠為光合過程中氣體的交換提供足夠的空間，柵欄組織和海綿組織的協同優化可以更有效地促進苜蓿光合作用的提高［22］。在本研究中，施氮處理下的胞間CO2濃度低于不施氮處理，這可能是由于施氮條件下苜蓿凈光合速率增加，同時葉片內的CO2消耗加快，氣體交換的速度并不能達到葉片同化CO2的速率，從而導致胞間CO2濃度的下降。

逆境常常抑制植物光合作用，使得植物光合作用能力明顯降低［23］。大多數植物在夏季中午均有光合“午休”的現象，特別是在干旱脅迫以及營養供給不足等逆境條件下。本研究中，不同施氮水平下，紫花苜蓿凈光合速率日變化均呈不對稱“雙峰”曲線，中午14：00出現光合“午休”，此時光抑制程度最嚴重。與前人的研究結果相比［24］，本研究中的光合“午休”出現的時間延遲了1～2 h，導致光合午休出現時間不一致，一部分原因可能是試驗地點處于不同的時區，具有2 h左右的時差，還可能是因為苜蓿生長的年限不同，本研究是在苜蓿種植的第2年進行，對強光照和高溫具有很好的適應性，而前人的研究中苜蓿生長年限在4年以上，這時苜蓿的生長性能及光合能力均有所下降，進而導致光合作用的高峰和低谷出現時間有所差異［25］。另有研究認為，苜蓿并不全會出現光合“午休”現象，本研究結果與此不一致，可能是由于未出現光合午休的苜蓿品種具有較強的光合能力和應對高溫環境的適應能力，以及灌溉方式、光照輻射和空氣濕度的高低不同等［26］。

植物葉片光合作用的氣體交換主要受氣孔因素和非氣孔因素的影響［27］，本研究中，苜蓿葉片凈光合速率和氣孔限制值隨著施氮量的增加呈先增加后降低的趨勢，而胞間CO2濃度呈先降低后增加的趨勢，不同施氮條件下苜蓿葉片凈光合速率和胞間CO2濃度呈負相關，這說明低氮和高氮條件下苜蓿光合作用主要受到非氣孔因素的影響，這可能是由于低氮和高氮均會對苜蓿造成脅迫，導致苜蓿光合酶受到抑制從而使光合能力下降［27］。本研究中，在10：00-12：00，苜蓿凈光合速率和氣孔限制值呈上升的趨勢，而胞間CO2濃度呈下降的趨勢，這說明在這個時間段凈光合速率主要受到環境因子和光合活性的影響，與胞間CO2濃度的變化關系不大；在12：00-16：00，苜蓿葉片的凈光合速率和胞間CO2濃度均呈先降低后增加的趨勢，氣孔限制值呈相反的趨勢，凈光合速率和胞間CO2濃度呈正相關，這說明光合“午休”的出現主要受到胞間CO2濃度的限制，這可能是由于中午光照強，氣溫高，苜蓿葉片水分蒸發快，為了適應外界環境變化，苜蓿葉片部分氣孔關閉，導致葉片氣孔導度下降［24］，從而影響苜蓿葉片內CO2的交換；在16：00-20：00，這個時間段與上午12：00之前規律一致，凈光合速率和氣孔限制值與胞間CO2濃度均呈負相關，說明這個時間段限制凈光合速率的主要是光照強度和光合活性的下降。

3.3 不同氮素水平對紫花苜蓿葉片形態結構的影響

葉片是苜蓿進行光合作用的主要場所，光合作用是苜蓿干物質產量形成的基礎，葉片形態作為苜蓿生產最重要的生長指標，是除單葉光合速率以外決定最終干物質產量的重要參數［28-29］。植物葉片的形態結構變化與其生理功能和外界環境密切相關，在長期氮肥添加的影響下，葉片的形態結構會發生一定的生理性適應［19］。氮素對苜蓿葉片形態結構的影響是多方面因素綜合作用的結果，研究表明，氮素對植物葉片柵欄細胞的分裂和發育以及海綿細胞的發育有促進作用，尤其是在植物生長中后期，隨著氮含量的增加這種促進作用逐漸增強［2］。氮還是光合色素合成的必要成分，施氮可以提高光合色素含量，進一步提高葉片的光合固碳能力，在葉片氮限制的條件下，添加適宜的氮肥有助于提高植物的光能利用效率［23］。本研究中，施氮處理苜蓿葉長、葉寬、葉面積均顯著高于不施氮處理，這與前人的研究相一致［30］。氮是葉綠素和光合蛋白質的重要組成部分，能夠有效地促進葉片的生長［31］。葉面積的增大能有效增加植物葉片的捕光面積，提高植物的生長速率，但是，葉面積的增大會升高植物的蒸騰速率，造成細胞水勢和膨壓的升高。而當氮肥過量時會造成葉片CO2同化能力降低，不利于中后期葉片光合同化物的積累與運輸，進而抑制苜蓿的葉片生長。氮素除了直接作用于植物葉片面積的增加，還能夠延緩葉片的衰老。研究表明，葉片衰老與植物體自身的生命周期有關，并受到葉片氮缺乏的誘導，葉片氮缺乏最先出現在下層葉片上，從葉尖沿著葉片中脈向著葉片基部逐漸失綠干枯［22］。有研究表明，ORE1是調控擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉片自然衰老的關鍵轉錄因子，過量表達會誘導葉片提前出現衰老，其中ORE1是缺氮誘導葉片衰老的主要因素，并受到NLA/PHO2的調節［8］。此外，施氮還能夠促進比葉重的增加，升高的比葉重主要是由于柵欄葉肉層的增加或者柵欄細胞的延伸，與此同時，葉片韌性和密度會影響葉片色素的含量和分布，從而說明比葉重和光合作用密切相關［22］。

4 結論

施氮能夠增加紫花苜蓿的凈光合速率、蒸騰速率和水分利用效率，降低胞間CO2濃度。隨著施氮量的增加，紫花苜蓿的葉長、葉寬、葉面積、比葉重，以及葉片干重、莖稈干重、干物質產量、葉片氮含量、淀粉和可溶性糖含量均呈先增加后降低的趨勢。綜合來看，增施氮肥有助于苜蓿光合面積和光合速率的協同改進，有利于光合產物的合成，從而促進苜蓿干物質產量的提高，當施氮量為120 kg·hm-2時提升效果最為明顯。