末次刈割時間對苜蓿根頸抗氧化系統及抗寒性的影響

陳衛東，張玉霞，2*，張慶昕，劉庭玉，王顯國，王東儒

（1.內蒙古民族大學農學院，內蒙古 通遼 028041；2.內蒙古自治區飼用作物工程中心，內蒙古 通遼 028000；3.中國農業大學草業科學與技術學院，北京 100193；4.呼和浩特市農牧技術推廣中心種業發展科，內蒙古 呼和浩特 010000）

紫花苜蓿（Medicago sativa）作為優質的多年生豆科牧草，是我國種植面積最大的牧草之一，在我國畜牧業生產中發揮著至關重要的作用［1-2］。科爾沁沙地位于中國農牧交錯帶東段，頻繁的風沙災害加之不合理的人為活動導致科爾沁沙地成為中國北方地區沙漠化最典型的地區之一［3-4］。近幾十年來農耕界限不斷北移，大面積草原被開墾為農田，昔日波狀起伏的疏林沙質草原逐漸變為今日典型的農牧交錯區［5］。在“十三五”期間通過機械播種、切割壓扁摟曬、打捆機械化技術、節水灌溉體系，在科爾沁沙地穩固地建立了700 hm2苜蓿生產基地［6］。科爾沁沙地冬季少雪，冬春土壤溫濕度變化劇烈［7-8］，在科爾沁沙地種植苜蓿面臨嚴重的低溫冷凍和倒春寒問題［9-10］。凍害是限制這一地區苜蓿持續穩定生產的關鍵問題，安全越冬是我國北方干旱地區實現苜蓿穩產高產的基礎。影響苜蓿越冬率的因素有很多，如氣溫、降水、土壤質地與肥力、品種選擇、刈割制度、灌溉措施等，其中末次刈割時間是影響苜蓿越冬率的重要栽培管理因素之一［11-14］，目前關于苜蓿的末次刈割時間，許多學者有不同見解，有學者認為第1次“殺霜（氣溫首次降至-20℃）”之前4～6周是中、高維度地區苜蓿刈割秋季敏感期（fall critical period），此時期刈割將降低苜蓿草地的持久性和來年的草產量［15-16］；也有一些學者的研究表明，如果苜蓿品種秋眠和抗病性強、土壤肥力高、刈割次數和生育時期（或間隔期）適宜，秋季刈割就不會造成草地持久性和產草量降低［17-18］。這種有關末次刈割做法的爭議，究竟孰是孰非，還是需要因地制宜，還有待于更多的研究去佐證。根系是植物吸收養分、轉化和儲藏營養物質的重要器官［19］，研究表明，根頸中抗氧化系統與植物抗逆性存在密切關系［20］。孫浩等［21］研究表明，末茬秋季敏感期刈割導致阿魯科爾沁旗苜蓿越冬率降低，但未對苜蓿根頸中抗氧化系統做深入研究，苜蓿根系中的抗氧化酶活性在植物越冬期間存在怎樣的變化規律及其與越冬有無直接聯系還需進一步探究。為此，開展末次刈割時間調控科爾沁沙地苜蓿越冬的生理機制研究，探究苜蓿根頸抗氧化系統變化，分析科爾沁沙地秋末是否應該刈割及最佳刈割時期，對確定該地區適宜的末次刈割時間，確保苜蓿安全越冬，指導苜蓿生產具有重要意義，亦可為苜蓿抗寒越冬研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于內蒙古通遼市開魯縣東風鎮林輝草業公司（43°37′N，121°34′E），年平均氣溫為6.2 ℃，最低氣溫為-30～-25 ℃，＞10 ℃年活動積溫為3137 ℃，＜0 ℃的天數為86～98 d，年平均日照時數為3000 h，無霜期為135～145 d，年平均降水量為376.1 mm，蒸發量是降水量的4.8 倍，年平均風速為3.1～4.3 m·s-1，為典型的溫帶大陸性季風氣候。試驗田土壤為沙土，新開墾沙化草地，0～20 cm 土層土壤理化性質為：pH 值8.2，有機質含量6.3 g·kg-1，全氮含量 0.37 g·kg-1，堿解氮含量 36.17 mg·kg-1，速效鉀含量 76.78 mg·kg-1，速效磷含量 3.68 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗材料為公農1 號紫花苜蓿品種，來自吉林省農業科學院草原所。于2019 年7 月30 日進行播種，播種量22.5 kg·hm-2，條播行距15 cm，試驗小區面積為16 m2（4 m×4 m），3 次重復，共設30 個小區，小區之間設0.5 m過道。施肥量為 75 kg·hm-2K2O，100 kg·hm-2P2O5，翌年再次施入 150 kg·hm-2K2O 與 200 kg·hm-2P2O5，K2O 分兩次施入，分別為 4 月 3 日和 6 月 3 日各施入 75 kg·hm-2，P2O5于 4 月 3 日一次性施入，磷肥為過磷酸鈣（P2O5含量為44%），鉀肥為氯化鉀（K2O 含量為60%），所有小區分別于2020 年5 月1 日和7 月3 日進行第一與二茬刈割。采用隨機區組試驗設計，于 2020 年 8 月 25 日-11 月 5 日，每 10 d 一個刈割時間，分別為 8 月 25 日，9 月 5、15、25 日，10月5、15、25 日，11 月5 日，共設置8 個刈割時間，以未刈割為對照（CK）。紫花苜蓿生長過程中進行適時噴灌、除草、防治病蟲害等田間管理。于封凍前期（11 月15 日）挖取紫花苜蓿越冬材料（苜蓿根系），每個小區挖取90 株（粗細均勻一致），平均分成6 份。將其中1 份越冬材料放在4 ℃冰箱進行低溫冷藏處理，剩余5 份于可程式恒溫恒濕試驗箱（東莞市昊昕儀器設備有限公司）模擬低溫冷凍處理，處理時將根系先用脫脂棉包裹，加適量水，再用錫紙包裹，注明編號，處理溫度分別為-10，-15，-20，-25 和-30 ℃，以 0 ℃為起點，4 ℃·h-1的速率降溫，到達預設溫度后保持6 h，再以4 ℃·h-1的速率升溫至0 ℃，取出置于4 ℃下保持12 h。低溫處理結束后，分別切取根頸（根頸及根頸下主根1 cm），測定相對電導率及抗氧化特性。

1.3 測定指標及方法

采用DDS-302 電導率儀（產地：成都）測定電導率［22］，采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量［22］，采用愈創木酚比色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性［22］，采用氮藍四唑比色法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［22］，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性［22］。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件進行數據處理、作圖和制作表格，結果用“平均值±標準差”表示，各低溫處理下的相對電導率數據使用 SPSS 17.0 軟件擬合 Logistic 回歸方程［23-24］：y=k/（1+ae-bx），其中y為相對電導率值，x為處理溫度，k為當x趨于無窮大時的值，a 與b 為方程參數，相對電導率的極大值與極小值的中位數對應的溫度為低溫半致死溫度（semi-lethal temperature，LT50）。

2 結果與分析

2.1 不同末次刈割時間對苜蓿根頸半致死溫度（LT50）的影響

不同末次刈割時間的苜蓿受不同低溫脅迫后相對電導率擬合Logistic 回歸方程均不同，差異顯著水平均小于0.05（表 1）。結果顯示，在未刈割、8 月 25 日、9 月 5 日、9 月 15 日、9 月 25 日、10 月 5 日、10 月 15 日、10 月 25 日、11 月5 日進行末次刈割時，半致死溫度分別為-18.03、-17.61、-17.03、-16.59、-15.80、-15.82、-16.83、-16.34、-17.12 ℃。由此說明，在不同末次刈割時間的苜蓿抗寒能力強弱為：未刈割＞8 月25 日＞11 月5 日＞9月 5 日 ＞ 10 月 15 日 ＞ 9 月 15 日 ＞ 10 月 25 日 ＞ 10 月 5 日 ＞ 9 月 25 日 。

表1 不同末次刈割時間苜蓿根頸相對電導率擬合Logistic回歸方程及LT50Table 1 The Logistic regression equation and LT50 of relative conductivity of alfalfa root-neck under different last cutting time

2.2 不同末次刈割時間的苜蓿根頸在不同低溫處理下MDA 含量的變化

隨著溫度的降低，苜蓿根頸的MDA 含量呈逐漸升高的變化趨勢（表2），在-30 ℃下MDA 含量最高，且均與-20℃及以上溫度處理差異顯著（P＜0.05）。除9月5日刈割時間處理下-30與-25℃處理差異不顯著外（P＞0.05），其他刈割時間處理二者均差異顯著（P＜0.05），由此說明在低溫脅迫下，苜蓿根頸會受到傷害，且低溫脅迫溫度越低，苜蓿根頸受傷害程度越大，說明MDA含量可以評價苜蓿受傷害程度。

表2 不同末次刈割時間苜蓿根頸在低溫處理下MDA含量的變化Table 2 Changes of MDA content in alfalfa root-neck at different last cutting times under low temperature treatment（nmol·g-1 FW）

在-15與-20℃處理下，9月25日末次刈割時間處理根頸的MDA含量最高，其中-15℃處理下均顯著高于其他刈割時間處理，-20℃處理下顯著高于未刈割、8月25日、9月5日、10月15日、11月5日刈割（P＜0.05）；在-25與-30℃低溫脅迫處理下，10月5日末次刈割時間處理根頸的MDA含量最高，且均顯著高于其他刈割時間（P＜0.05），未刈割處理苜蓿根頸的MDA含量最低，除8月25日末次刈割時間處理外均顯著低于其他刈割時間處理（P＜0.05）；由此說明，不同刈割時間處理下的苜蓿根頸的MDA含量在低溫脅迫下存在明顯差異，9月25日與10月5日刈割處理MDA含量較高，未刈割、8月25日、9月5日、10月15日、11月5日刈割處理的MDA含量較低。由此進一步說明，9月25日與10月5日刈割的苜蓿抗寒性較弱，與其在低溫脅迫下MDA含量較多有關，反之未刈割、8月25日、9月5日、10月15日、11月5日刈割處理抗寒性較強與其在低溫脅迫下MDA含量較少密切相關；因此，苜蓿根頸的MDA含量可以反映其抗寒性強弱。

2.3 不同末次刈割時間苜蓿根頸在不同低溫處理下SOD活性變化

隨著溫度的降低，苜蓿根頸的SOD活性呈逐漸升高的變化趨勢（表3），在-30℃低溫脅迫下SOD活性最強，且均與-20℃及以上溫度處理差異顯著（P＜0.05），除9月25日、10月25日、11月5日刈割處理-30與-25℃低溫脅迫處理差異不顯著外（P＞0.05），其他刈割時間處理二者均差異顯著（P＜0.05），由此說明在低溫脅迫下，苜蓿根頸受到傷害從而產生超氧陰離子，植株通過增強SOD活性，清除超氧陰離子，維持活性氧平衡，且在-30℃低溫冷凍脅迫處理下，仍具有較強的清除能力，由此說明SOD是苜蓿抵御低溫冷凍脅迫的抗氧化酶之一。

表3 不同末次刈割時間苜蓿根頸在低溫處理下SOD活性的變化Table 3 Changes of superoxide dismutase activity in alfalfa root-neck with different last cutting time under low temperature treatment（U·g-1 FW）

在-30～-15℃低溫脅迫下，9月25日末次刈割處理苜蓿根頸的SOD活性最弱，在-15℃低溫脅迫處理下顯著低于未刈割、8月25日刈割處理，-20℃處理下顯著低于其他刈割處理（P＜0.05），-25℃處理下則顯著低于未刈割、8月25日、10月15日、11月5日刈割處理（P＜0.05），-30℃處理下顯著低于除10月25日刈割外的其他處理（P＜0.05），由此說明，不同刈割時間苜蓿根頸的SOD活性在低溫脅迫下存在明顯差異，9月25日刈割處理相對較弱，未刈割、8月25日、10月15日、11月5日刈割則相對較強。由此進一步說明，9月25日刈割的苜蓿抗寒性較弱，與其在低溫脅迫下SOD活性較弱有關，反之未刈割處理、8月25日、10月15日、11月5日刈割處理抗寒性較強與其在低溫脅迫下SOD活性較強密切相關。

2.4 不同末次刈割時間的苜蓿根頸在不同低溫處理下POD活性變化

隨著溫度的降低，苜蓿根頸的POD活性呈先升高后降低的變化趨勢（表4），在-25℃下POD活性最強，其中未刈割、9月5日、9月25日、10月5日、10月25日、11月5日刈割處理均與其他低溫差異顯著（P＜0.05），由此說明在低溫脅迫下，苜蓿根頸受到傷害會產生過氧化物，植株通過增強POD活性，清除過氧化物，維持活性氧平衡，且在-25℃處理下，清除能力最強，在-30℃處理下，POD活性減弱，說明苜蓿根頸清除過氧化物的能力減弱，由此說明POD亦是苜蓿抵御低溫冷凍脅迫的抗氧化酶之一。

表4 不同末次刈割時間苜蓿根頸在低溫處理下POD活性的變化Table 4 Changes of peroxidase activity in alfalfa root-neck with different last cutting time under low temperature treatment（U·min-1·g-1 FW）

在-30和-15℃處理下，10月5日刈割處理苜蓿根頸的POD活性最弱，在-15℃處理下顯著低于8月25日、9月5日、9月15日、10月25日刈割（P＜0.05），但在-20和-25℃處理下與其他處理差異不顯著（P＞0.05），在-30℃處理下顯著低于8月25日、9月5日、9月15日、9月25日刈割處理（P＜0.05）。由此說明，在不同刈割時間處理下的苜蓿根頸的POD活性在-15和-30℃低溫脅迫下存在明顯差異，但在-20和-25℃間差異不明顯，說明POD活性在-20℃及以下溫度處理下對刈割時間的響應不明顯。

2.5 不同末次刈割時間苜蓿根頸在不同低溫處理下CAT活性的變化

隨著溫度的降低，苜蓿根頸的CAT活性呈先升高后降低的變化趨勢（表5），在-20℃下CAT活性最強，且均與其他溫度處理差異顯著（P＜0.05），由此說明在低溫脅迫下，苜蓿根頸受到傷害產生H2O2，通過增強CAT活性，清除H2O2，維持活性氧平衡，且在-20℃低溫脅迫下，清除能力最強，在-20℃以下，CAT活性減弱，說明苜蓿根頸清除H2O2的能力減弱，由此說明CAT亦是苜蓿抵御低溫冷凍脅迫的抗氧化酶之一。

表5 不同末次刈割時間苜蓿根頸在低溫處理下CAT活性的變化Table 5 Changes of catalase activity in alfalfa root-neck with different last cutting time under low temperature treatment（U·min-1·g-1 FW）

在-25～-10℃低溫冷凍處理下，10月5日末次刈割時間處理苜蓿根頸的CAT活性最弱，在-10℃處理下顯著低于未刈割、8月25日、10月15日、10月25日刈割處理（P＜0.05），-15℃處理則顯著低于未刈割、8月25日、9月5日、9月25日、10月15日、10月25日刈割處理（P＜0.05），-20℃處理顯著低于未刈割、8月25日、9月5日、10月15日、10月25日刈割處理（P＜0.05），-25℃處理下顯著低于未刈割、8月25日、9月5日、9月25日、11月5日刈割處理（P＜0.05），但均與9月15日刈割處理差異不顯著（P＞0.05）。由此說明，不同刈割時間處理下的苜蓿根頸的CAT活性在低溫脅迫下存在明顯差異，9月15日和10月5日刈割相對較弱，未刈割、8月25日、9月5日、10月15日、10月25日刈割則相對較強。由此進一步說明，9月15日和10月5日刈割的苜蓿抗寒性較弱，與其在低溫脅迫下CAT活性較弱有關，反之未刈割處理、8月25日、9月5日刈割處理抗寒性較強與其在低溫脅迫下CAT活性較強密切相關。

2.6 苜蓿根頸的半致死溫度與其抗氧化系統的相關性

由表6可知，不同低溫脅迫下紫花苜蓿根頸的LT50均與MDA含量呈正相關，且在-15℃及以下溫度呈顯著或極顯著正相關，與抗氧化酶活性呈負相關（除-20℃的POD活性）；紫花苜蓿根頸的半致死溫度與-10℃低溫條件下的POD活性呈顯著負相關（P＜0.05），與-20℃下的CAT活性呈顯著負相關（P＜0.05），與-15、-20和-25℃條件下SOD活性呈顯著或極顯著負相關。

表6 不同末次刈割時間苜蓿根頸的半致死溫度與其抗氧化系統的相關性Table 6 Correlation between the semi-lethal temperature of alfalfa root-neck and its antioxidant system in different last cutting times

3 討論與結論

關于末次刈割處理對苜蓿抗寒性的研究主要采用田間自然降溫脅迫處理的方法［25］，通過測定翌年的越冬率衡量苜蓿抗寒性的強弱，抗氧化系統指標通過越冬期不同自然降溫處理時期取樣測定，這種方法易受外界環境影響，且冬季取樣困難。近年來，末次刈割處理對苜蓿抗寒性的研究開始采用可程式恒濕恒溫試驗箱人工模擬低溫處理的方法［26］，利用半致死溫度衡量苜蓿的抗寒性強弱，這種方法能夠有效避免外部環境因素的影響，取樣測定抗寒生理指標簡單方便且更加準確。為此，本試驗通過大田培養紫花苜蓿材料，采用人工模擬低溫脅迫的方法，獲得半致死溫度判定不同末次刈割時間處理紫花苜蓿抗寒性的差異。結果表明，不同末次刈割時間處理的紫花苜 蓿 抗 寒 性 強 弱 為：未 刈 割＞8月25日＞11月5日＞9月5日＞10月15日＞9月15日＞10月25日＞10月5日＞9月25日；因此，在科爾沁沙地9月5日之前與11月5日之后進行末次刈割為相對安全期，9月5日-9月25日與10月5日-11月5日進行末次刈割為相對危險期，9月25日-10月5日進行末次刈割為危險期。

植物受到低溫脅迫時，會導致細胞內活性氧增加［27-28］，植物細胞膜系統在受到氧化傷害后產生MDA，其含量多少可反映細胞膜脂過氧化的程度，也常用來反映細胞膜受破壞的程度［29］。有研究表明，植物在逆境條件下，其細胞可通過多種途徑產生超氧陰離子、H2O2等活性氧，超氧陰離子和H2O2可進一步反應生成毒性更強的羥自由基（OH-），它能轉化脂肪酸為有毒的過氧化物，使得生物膜被破壞，造成MDA的累積［30］。本研究中，紫花苜蓿根頸的MDA含量隨著溫度的降低均增加，這與徐洪雨等［31］、程嘉惠等［32］的研究結果一致，且在-15、-20、-25與-30℃處理下，紫花苜蓿根頸在9月25日或10月5日末次刈割時MDA含量最高，表明此時紫花苜蓿根頸細胞膜破壞最嚴重，受傷程度最大，因此，此時刈割處于危險期。

逆境脅迫下，植物會啟動一系列生理響應來應對活性氧過量積累所形成的過氧化脅迫，有研究表明，SOD、POD、CAT等抗氧化酶在植物抵御低溫氧化損傷方面起著至關重要的作用［33-34］。李春燕等［35］研究表明，隨低溫脅迫持續時間的延長，小麥（Triticum aestivum）SOD、POD和CAT活性均呈先上升后下降的變化趨勢。本試驗表明，隨著溫度的下降，紫花苜蓿根頸的POD、CAT活性呈先升高后降低的變化趨勢，而SOD活性呈一直增加的趨勢，說明低溫脅迫可激發紫花苜蓿根頸中POD、CAT、SOD活性，SOD活性的一直升高可能是由于其在低溫冷凍下依然起到保護作用，這與亓春宇等［36］的研究結果一致。通過苜蓿根頸的半致死溫度與抗氧化系統的相關分析表明，在4與-10℃處理下，紫花苜蓿根頸的POD活性與其半致死溫度呈顯著負相關，在-20℃處理下，紫花苜蓿根頸的CAT活性與其半致死溫度呈顯著負相關，在-15、-20與-25℃處理下，紫花苜蓿根頸的SOD活性與其半致死溫度呈顯著或極顯著負相關，因此末次刈割時間通過調控苜蓿根頸的SOD、POD、CAT活性，協同作用清除活性氧、過氧化物、過氧化氫，降低膜脂過氧化程度，從而提高其抗寒性。