鼠李糖乳桿菌B6抗氧化活性和細胞保護作用研究

李瑞盈，張怡琳，游春蘋*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海乳業生物工程技術研究中心，乳業生物技術國家重點實驗室，上海，200436)

氧化應激被定義為活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成以及抗氧化防御活性氧之間的嚴重失衡，導致生物分子的過度氧化損傷[1]。氧化應激是衰老和年齡相關疾病的基本原因之一[2-4]。多項研究表明，乳酸菌、雙歧桿菌等具有良好的抗氧化能力，能夠使抗氧化酶活性得以提高，并對氧化應激起到調節和緩解的作用。因此，具有抗氧化潛力的乳酸菌可作為食品發酵的功能性發酵劑，有望在功能食品領域發揮作用，給宿主帶來健康益處[5-7]。

對于乳酸菌的抗氧化特性已經有很多學者進行過研究，李喚宇[8]利用植物乳桿菌Y44干預偶氮二異丁脒鹽酸鹽造成氧化損傷的人腸上皮細胞Caco-2，結果發現植物乳桿菌Y44不僅調控了一系列抗氧化酶的表達，還可激活Nrf2-Keap1-ARE信號通路，使Caco-2細胞的抗氧化活性顯著增強。HOU等[9]研究發現植入乳桿菌L.plantarumJ26對H2O2誘導的Caco-2細胞超氧化物歧化酶活性的降低和谷胱甘肽過氧化物酶活性的升高具有顯著的保護作用。NEMETH等[10]以H2O2處理的Caco-2細胞作為模型系統，研究炎癥反應和誘導細胞死亡，研究結果發現植物乳桿菌L.plantarum2142濃縮培養上清液對H2O2介導的氧化應激存在保護作用。

益生性乳酸菌通過“腦-腸-微生物軸”改善精神健康的作用已經得到越來越多研究的證實[11]，但少有利用益生菌代謝產物對于H2O2造成神經細胞氧化損傷保護作用的研究。PC12細胞作為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤分化的細胞株，不僅具有神經內分泌細胞的一般特征，且可傳代易培養，在體外培養中表現出聚集成團和有纖維狀突起等生長特征，類似于神經元，因此經常被作為神經生理和藥理研究的細胞模型。此外，有學者研究了植物提取物對PC12細胞氧化損傷的保護作用，CHU等[12]發現美洲罌粟花提取物能夠減輕H2O2誘導的PC12細胞的細胞毒性，緩解氧化受損細胞的氧化應激，維持細胞內ROS穩態。CLEMENTI等[13]發現紅褐藻素通過調節ROS水平降低H2O2誘導的PC12細胞的細胞毒性和凋亡。OLATUNJI等[14]研究發現枸杞中的反式-N-咖啡酰胺通過減輕氧化應激，提高過氧化氫酶、SOD活力和還原型谷胱甘肽)的含量，抑制ROS生成和Ca2+內流。益生菌代謝產物用于對氧化損傷PC12細胞保護作用的研究還非常少，因此，有必要建立一套保護神經細胞抗氧化損傷的益生菌篩選和評價方法。

本文就結合了體外化學方法和細胞層面的分析，首先對實驗室保藏的4株乳桿菌發酵過程中不同組分的DPPH自由基、·OH、·O2-清除能力做了比較研究，篩選出綜合抗氧化能力較全面的鼠李糖乳桿菌B6，并在PC12細胞氧化損傷模型中，對丙二醛(malondialdehyde，MDA)和ROS的含量進行檢測，從化學檢測到細胞層面對菌株的抗氧化能力進行綜合分析，旨在為開發利用該菌株保護神經細胞抗氧化用途提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：鼠李糖乳桿菌B6 (Lactobacillusrhamnosus，CGMCC 13310)，鼠李糖乳桿菌KF7 (Lactobacillusrhamnosus, CGMCC 6430)，副干酪乳桿菌BD5115 (Lactobacillusparacasei, CGMCC 20045)，干酪乳桿菌LC2W(Lactobacilluscasei, CGMCC 0828)，光明乳業研究院菌種保藏庫；鼠李糖乳桿菌LGG (LactobacillusrhamnosusGG，ATCC 53103)，ATCC菌種保藏中心。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞PC12(GE0414)，江蘇建諾為生物技術有限公司。

脫脂乳粉，新西蘭恒天然公司；MRS肉湯培養基，德國Merck公司；DPPH、無水乙醇、鄰二氮菲、FeSO4、Tris-HCl、鄰苯三酚，生工生物工程(上海)股份有限公司；3% H2O2，Sigma試劑公司；胎牛血清、細胞培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養液，HyClone公司；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、抗生素(青霉素-鏈霉素)，賽默飛世爾科技公司；Cell Counting-Kit-8(CCK8試劑盒)，美國Gibco公司；MDA含量檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒，碧云天試劑有限公司。

培養基：10%(質量分數，下同)脫脂乳培養基(115 ℃、滅菌15 min)；MRS培養基(121 ℃、滅菌15 min)；DMEM完全培養基由94% DMEM培養液，5%的胎牛血清，1%抗生素(青霉素-鏈霉素)組成。

1.2 主要儀器與設備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，三洋電機株式會社；WNB45L4恒溫水浴鍋，美墨尓特(上海)貿易有限公司；Spectra M5型酶標儀，美國Molecular Devices公司；A35厭氧生化培養箱，英國Don Whitley Scientific公司；SCIENTZ-IID超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；5424R高速離心機，德國Eppendorf公司；Olympus IX71倒置顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；HERAce11240CO2型恒溫培養箱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的培養及發酵上清液，菌體的制備

發酵上清液制備：將MRS固體培養基上活化得到的單菌落接種到MRS液體培養基或脫脂乳培養基中37 ℃培養18～24 h，將上述菌液按照3%(體積分數，下同)的接種量接種到MRS培養基或脫脂乳培養基中繼續活化18～24 h，8 000 r/min 4 ℃離心15 min得到發酵上清液。

活化菌體：收集MRS發酵菌液離心得到的菌體，用PBS(pH 7.4)洗滌(10 000 r/min 4 ℃離心8 min)3次，4 ℃保存備用(菌體濃度為2.0×108CFU/mL)；

熱滅活菌體：用PBS(pH 7.4)洗滌菌體，將菌體重懸后置于恒溫水浴鍋中滅活(98 ℃, 1 h)，PBS清洗沉淀3次(10 000 r/min 4 ℃，8 min)[15]；

1.3.2 清除DPPH自由基實驗

參考MARYAM等[16]的方法并略作修改，DPPH用無水乙醇溶解并配制為終濃度0.4 mmol/L，現用現配，待測液和DPPH乙醇溶液各取2 mL混合均勻，室溫下避光反應(30 min)后，8 000 r/min室溫離心10 min，測定上清液在517 nm處的吸光度，測3組平行。DPPH自由基清除率按公式(1)計算：

(1)

式中：Ai，實驗組吸光度值；A0，對照組(2 mL 無菌水+2 mL DPPH乙醇溶液)吸光度值；Aj,空白組(2 mL 待測液+2 mL 無水乙醇)吸光度值。

1.3.3 清除·OH實驗

參考YANG等[17]的方法并略作修改。實驗組As：試管中分別依次加入PBS(1 mL，0.05 mmol/L pH 7.4)，鄰二氮菲(0.5 mL，6 mmol/L)、FeSO4溶液(0.5 mL，6 mmol/L)和H2O2溶液(0.5 mL，0.1%)，充分混合均勻后再加入0.5 mL樣品；對照組Ac：用0.5 mL 蒸餾水取代0.5 mL樣品；空白組Ab：用1 mL 蒸餾水取代樣品和H2O2溶液；將混合液在37 ℃水浴條件下反應1 h，利用酶標儀測定其在536 nm處的吸光值。·OH清除率按公式(2)計算：

(2)

1.3.4 清除·O2-實驗

參考李穎等[18]的方法并略作修改。A樣：依次加入3 mL 50 mmol/L的Tris-HCl，1 mL樣品，1 mL 1.2 mmol/L的鄰苯三酚；A空：將實驗組中樣品用蒸餾水代替；充分混勻各體系后，反應25 min(室溫或25 ℃水浴)，利用酶標儀測定325 nm處的吸光值。·O2-清除率按公式(3)計算：

(3)

1.3.5 B6對PC12 細胞抗氧化功能的影響實驗

1.3.5.1 PC12細胞的培養

將PC12細胞復蘇后，加入DMEM完全培養基(5%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素混合液)，并培養在37 ℃，含有5% CO2的恒溫細胞培養箱中，每隔1 d換1次液，2 d傳1次代，實驗所選用的PC12細胞均處于對數生長期。

1.3.5.2 H2O2誘導氧化損傷PC12 細胞模型的建立

PC12細胞以3.0×104個/mL的密度接種于96孔板，在培養24 h后，更換培養液為無血清DMEM培養基(99% DMEM培養液，1%青霉素-鏈霉素混合液，下同)再培養20 h；設置空白對照組(無H2O2)和H2O2終濃度分別為400、500、600、700、800 μmol/L的5個濃度梯度組，每組設6個復孔，作用20 h后，按照1.3.5.4中的CCK8法測定PC12細胞的存活率，并將細胞存活率最接近50%的H2O2濃度作為最適的造模濃度。

1.3.5.3 實驗細胞分組

以3.0×104個/mL的密度將PC12細胞接種到細胞培養板中，在培養24 h后將培養液換為不含胎牛血清的DMEM培養液使細胞饑餓20 h，之后對其進行實驗分組。空白對照組：添加無血清DMEM培養基再培養24 h；空白脫脂乳組：添加未發酵脫脂乳含量為15%的無血清DMEM高糖培養基，預處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續培養20 h；模型組：添加無血清DMEM培養基培養4 h后，加入終濃度為500 μmol/L的H2O2繼續培養20 h；低濃度實驗組：添加鼠李糖乳桿菌B6代謝產物含量為5%的無血清DMEM培養基，預處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續培養20 h；中濃度實驗組：添加鼠李糖乳桿菌B6代謝產物含量為10%的無血清DMEM培養基，預處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續培養20 h；高濃度實驗組：添加鼠李糖乳桿菌B6代謝產物含量為15%的無血清DMEM培養基，預處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續培養20 h；陽性對照組：配制終濃度為200 μmol/L的維生素C溶液作為陽性對照，預處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續培養20 h。

1.3.5.4 CCK8法測定細胞存活率

根據李盡文等[19]的方法，將PC12細胞以3.0×104個/mL的密度接種于96孔板中，CO2恒溫培養箱中培養24 h，之后所有組更換為無血清的DMEM培養基繼續培養20 h后，除空白對照組和模型組外，實驗組更換為鼠李糖乳桿菌B6代謝產物含量分別為5%、10%、15%的溶液，進行預處理(4 h)；除對照組外，模型組和實驗組加入終濃度為500 μmol/L的H2O2繼續培養20 h。孵育結束后，分別在各組的前3個孔中加入10 μL的CCK8溶液，避光孵育2～4 h后，通過酶標儀測定450和650 nm時各孔的吸光度。細胞存活率按公式(4)計算：

(4)

式中：A，實驗組的吸光度值(A450-A650)；A0，對照組的吸光度值(A450-A650)。

1.3.5.5 倒置顯微鏡觀察細胞形態

將PC12以3×104個/mL的密度接種到6孔板，按照1.3.5.4進行實驗分組處理后，在倒置顯微鏡(×20)下觀察不同組的細胞生長狀態并拍照記錄。

1.3.5.6 MDA和ROS含量測定

采用試劑盒測定，按照說明操作。

1.4 數據統計與分析

實驗數據表示為“均值±標準偏差”的形式，利用SPSS進行單因素方差分析進行多組間的比較，顯著水平設為P<0.05。

2 結果與討論

2.1 DPPH 自由基清除率

DPPH法是檢測化合物清除自由基或供氫能力以及評價食物抗氧化能力最常用的方法之一[20]。抗氧化劑對DPPH自由基的還原能力可以通過檢測其在515～528 nm處吸光度的下降來評估[21]。4株乳桿菌在2.0×108CFU/mL濃度下各組分的DPPH 自由基清除率如圖1所示。

圖1 幾株乳酸菌不同組分對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of different lactic acid bacteria strains注：圖中不同字母表示各組的差異存在統計學意義(P<0.05)(下同)

由圖1可知，4株乳桿菌發酵MRS上清液，菌體均表現出較好的DPPH自由基清除能力，但其差異較大。B6、KF7和BD511的MRS發酵上清液DPPH自由基清除能力較強，分別為(63.23±1.38)%、(89.21±0.33)%、(77.26±2.30)%，高于LGG的(47.92%±0.34%)，且差異具有統計學意義(P<0.05)，其中鼠李糖乳桿菌KF7 發酵MRS上清液的DPPH自由基清除能力明顯高于其他菌株，其次是副干酪乳桿菌BD5115、鼠李糖乳桿菌B6。4株乳桿菌的活性菌體和滅活菌體對DPPH自由基的清除能力與LGG相比均未見優勢，鼠李糖乳桿菌B6滅活菌體對DPPH自由基清除能力高于其他3株菌。綜合看鼠李糖乳桿菌B6的DPPH自由基清除能力相對其他3株菌較全面。實驗結果表明，不同乳桿菌對DPPH的清除能力不同，發酵上清液對DPPH的清除能力均高于菌體，推測清除DPPH的活性物質主要存在于菌株的發酵上清液中[22-24]。

2.2 ·OH清除率

·OH被認為是氧化應激的主要來源。因此，抑制它們的形成或清除它們具有極其重要的生物學意義[25]。測定4株乳桿菌不同組分對·OH的清除能力進一步驗證其抗氧化能力，對比結果如圖2所示。

圖2 幾株乳酸菌不同組分對·OH的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of different lactic acid bacteria strains

由圖2可知，4株乳桿菌均呈現一定的·OH清除能力，鼠李糖乳桿菌B6發酵MRS上清液對·OH清除能力最強，清除率為(99.38±2.46)%，高于LGG的(98.12±0.20)%；4株乳酸菌活性菌體的·OH清除能力均低于LGG[(99.01±1.90)%]，其中鼠李糖乳桿菌B6清除率為(85.11±1.91)%，高于其他3株乳桿菌。鼠李糖乳桿菌B6滅活菌體對·OH清除率為(96.27±0.48)%，高于LGG的(93.66±0.34)%且和其他菌株差異具有統計學意義(P<0.05)。

實驗結果表明，不同乳桿菌對·OH的清除能力存在一定差異，其發酵代謝產物和菌體均可對·OH的清除起到作用。綜合來講，鼠李糖乳桿菌B6發酵MRS上清液、活性菌體和滅活菌體對·OH的清除能力最強，分別為(99.38±2.46)%、(85.11±1.91)%、(96.27±0.48)%。

2.3 ·O2-清除率

·O2-作為一種信號分子，調節許多生物過程，包括細胞凋亡和衰老[26]。然而，當·O2-產生過多或抗氧化防御缺乏時，氧化應激就會發生，從而破壞重要的生物分子并改變其生理功能[27]。乳酸菌發酵MRS上清液、活性菌體和滅活菌體清除·O2-的結果如圖3所示。

圖3 幾株乳酸菌不同組分對·O2-的清除能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging ability of different lactic acid bacteria strains

由圖3可知，4株乳桿菌的MRS發酵上清液、活性菌體和滅活菌體均呈現一定的·O2-清除能力，其中鼠李糖乳桿菌B6發酵MRS上清液和滅活菌體的·O2-清除能力最強，分別為(26.35±2.21)%、(17.53±8.02)%，高于LGG[(13.97±3.19)%、(5.96±3.69)%]及其余3株乳桿菌且差異具有統計學意義(P<0.05)；鼠李糖乳桿菌B6和副干酪乳桿菌BD5115活性菌體的·O2-清除能力最強，分別為(26.48±3.59)%、(25.70±3.33)%，高于LGG的(16.45±0.69)%且差異具有統計學意義(P<0.05)。

綜上，鼠李糖乳桿菌B6抗氧化能力較其他3株菌更為全面，其發酵MRS上清液較菌體的抗氧化綜合能力更強。

2.4 不同培養基鼠李糖乳桿菌B6發酵上清液自由基清除率

鼠李糖乳桿菌B6分別發酵MRS和脫脂乳得到發酵代謝產物，其中鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳得到的上清液對DPPH自由基和·O2-的清除率分別為(74.73±2.99)%、(34.78±2.60)%，都高于其發酵MRS上清液(表1)，且差異具有統計學意義(P<0.001)。

表1 不同培養條件下鼠李糖乳桿菌B6發酵 上清液自由基清除率Table 1 Free radical scavenging rate of B6 fermentation supernatant under different culture conditions

2.5 H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的最適濃度

PC12細胞經過不同濃度的H2O2處理，使正常的PC12細胞氧化，以得到實驗所需的細胞氧化損傷模型。如圖4所示，H2O2干預濃度達到500 μmol/L時，細胞的存活率達到53.51%，最接近50%。所以在建立PC12細胞氧化損傷模型時，條件為500 μmol/L的H2O2處理20 h。

圖4 不同濃度H2O2處理下的PC12細胞存活率Fig.4 Survival rate of PC12 cells treated with different concentrations of H2O2

2.6 鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物對PC12細胞形態的影響

由圖5可知，對照組的PC12細胞呈現清晰的角狀，是正常PC12細胞的形態；空白脫脂乳組對于細胞形態也沒有造成損傷；H2O2處理組細胞不再伸展偽足而是皺縮為圓形，說明H2O2氧化損傷造成細胞形態的劣變，而隨著鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物濃度的增加，細胞形態逐漸恢復正常，且濃度越高細胞的生長狀態越好，說明鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物緩解了細胞因為H2O2造成的氧化損傷。

a-對照組；b-空白脫脂乳組；c-H2O2處理組；d-低濃度(5%) B6代謝產物干預組；e-中濃度(10%)B6代謝產物干預組； f-高濃度(15%)B6代謝產物干預組；g-陽性對照組 (200 μmol/L 維生素C)圖5 鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物對H2O2 損傷的PC12細胞形態的影響(×20)Fig.5 Effect of L.rhamnosus B6 fermented skim milk metabolites on morphology of PC12 cells damaged by H2O2(×20)

2.7 PC12細胞培養液中MDA，ROS含量的測定

由圖6-a可知，空白脫脂乳組和空白對照組沒有顯著性差異，說明空白脫脂乳對細胞中的MDA含量沒有影響。而H2O2氧化損傷模型相對于空白對照組而言，MDA的含量顯著升高(P<0.05)，這說明H2O2會促進細胞脂質過氧化反應，使細胞的氧化損傷加重。受損的PC12細胞經含量10%、15%的鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物處理后，MDA含量從模型組的2.902 nmol/107cell分別降低至2.193、1.914 nmol/107cell，且與模型組差異具有統計學意義(P<0.05)，15%的高劑量組作用具有優于維生素C組的趨勢。進一步說明了鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物對細胞的脂質過氧化反應有一定的改善作用。

由圖6-b可知，經H2O2處理后的PC12細胞，細胞內的ROS含量顯著升高，說明H2O2會促進PC12細胞內ROS的產生。空白脫脂乳不會引起細胞內ROS含量顯著的變化。在經過鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物干預后，氧化損傷的PC12細胞內ROS含量有降低趨勢，15%含量的鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物干預組與模型組差異具有統計學意義(P<0.05)，且與陽性對照組水平相當，最接近空白對照組水平，這進一步表明鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物能夠一定程度上降低氧化損傷細胞內的ROS含量。

a-MDA;b-ROS圖6 鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物對H2O2 誘導的PC12細胞MDA及ROS含量的影響Fig.6 Effects of L.rhamnosus B6 fermented skim milk metabolites on MDA and ROS content in H2O2-induced PC12 cells

3 結語

研究表明，鼠李糖乳桿菌B6具有較好的抗氧化能力，其發酵MRS和脫脂乳的代謝產物均對DPPH、·OH、·O2-具有顯著的清除作用。通過建立PC12細胞氧化損傷模型，觀察其發酵脫脂乳代謝產物不同干預濃度對細胞形態的影響以及對細胞中MDA、ROS含量的影響，可進一步驗證鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物可以在一定程度上抑制或減少H2O2對PC12細胞造成的氧化損傷。研究結果可為鼠李糖乳桿菌B6發酵脫脂乳代謝產物作為天然抗氧化劑抑制PC12細胞的氧化損傷、保護神經提供一定的理論基礎。