單寧對葡萄酒香氣前鼻和鼻后閾值的影響

師戈圖，付建華，吳元，陳秋雨，鄭嘉婧，呂佳恒，李記明，唐柯*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，釀造微 生物學與應用酶學研究室，江蘇 無錫，214122)3(煙臺張裕集團有限公司，山東 煙臺，264000)

葡萄酒香氣是評價葡萄酒品質的重要指標，會顯著影響消費者的喜愛偏好[1]。香氣化合物是葡萄酒具有香氣特征的重要原因。香氣化合物的檢測閾值定義為其在食品或飲料中存在且能被檢出的最低濃度。因此，檢測閾值通常用作香氣化合物效力的衡量標準。通過確定香氣化合物的閾值和濃度，可以計算出化合物的氣味活性值(odor activity value，OAV)，以評估香氣化合物對食品香氣的特性貢獻度[2]。香氣感知可分為2種方式：前鼻感知和鼻后感知。前鼻感知發生在吸入過程中，鼻后感知則發生在口中進食期間[3]。無論是前鼻感知還是鼻后感知，香氣化合物都需要首先從食物基質中釋放出來，最后從鼻腔或口腔到達嗅覺受體[4]。因此，食物基質可能對前鼻感知或鼻后感知產生重大影響。

葡萄酒是一種包含多種不揮發和揮發性物質的復雜的酒精飲料，其非揮發性成分對香氣釋放的影響已被廣泛研究[5-6]。作為葡萄酒中重要非揮發性基質物質的單寧，已被證明能夠與香氣化合物相互作用，顯著改變香氣化合物的揮發性，進而影響葡萄酒的香氣感知[7-8]。如兒茶素和槲皮素可以極大地抑制溶液中的3-巰基己醇被感知，而沒食子酸表現出相反的效果[9]。通過確定酯類化合物的閾值，在兒茶素存在下，丁酸乙酯和辛酸乙酯的閾值分別增加了1及3倍[10]。最近的一項研究發現，在體內條件下多酚能夠減少口腔中大多數目標芳香化合物的釋放，并降低某些香氣屬性的一些強度評分。值得注意的是，作者認為多酚與一些口腔參數(如唾液或口腔黏膜)之間的相互作用可能會影響香氣的釋放[11]。事實上，單寧可以與唾液蛋白相互作用，導致形成一些聚集體，而這些聚集體同樣對香氣化合物的釋放具有顯著影響[12]。此外，通常發生在葡萄酒飲用過程中的感知相互作用也不容忽視，如單寧誘導的澀味和苦味也可能影響鼻后感知[13]。考慮到所有這些前提因素，單寧對前鼻和鼻后感知的影響可能會有不同的表現。然而，單寧對葡萄酒香氣前后鼻感知的影響規律及機制尚不明晰，是目前葡萄酒風味研究的一個熱點。

因此，針對上述問題，本研究旨在從前鼻和鼻后閾值角度評估單寧對葡萄酒香氣感知的影響。研究采用三點選配法(three-alternative forced-choice,3-AFC)結合最佳閾值估計法(best estimate threshold values，BETs)，在有無添加單寧的模擬葡萄酒中，分別確定了葡萄酒中常見的6種具有不同香氣的目標芳香化合物的前鼻檢測閾值(orthonasal threshold，ODT)和鼻后檢測閾值(retronasal threshold，RDT)。本研究不僅可以豐富我國葡萄酒風味化學研究的理論體系，同時也希望為基于不揮發基質單寧調控葡萄酒杯中以及飲用過程中香氣感知提供數據支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

去離子水、L-酒石酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；乙醇(色譜級)，安譜公司；商品單寧Tanin VR SUPRA，為縮合單寧，法國LAFFORT公司；香氣化合物標準品(色譜純，純度均在97%以上，見表1)，Sigma-Aldrich公司。

表1 用于測定的香氣化合物Table 1 Aroma compounds for test

1.2 實驗方法

1.2.1 品評員的篩選與培訓

品評員的初步篩選與培訓參考課題組前期建立的方法[14]，采用自愿報名的方式進行品評員的招募，通過填寫問卷的形式，對符合標準的60名20～22歲的江南大學學生進行了基本嗅覺及味覺等感官靈敏度測試，篩選出20人，進行為期1個月的基本感官培訓，并最終篩選出15人作為品評員，其中男性6名，女性9名。

1.2.2 香氣化合物嗅覺閾值測定

選擇6種葡萄酒中常見且具有不同化學結構或不同香氣屬性的香氣化合物進行閾值測定。閾值測定環境溫度為25 ℃，實驗方法采用國際標準3-AFC法[15]。參考相同類型的感官研究的方法，確定被測物質標準液在溶液體系中的濃度值為其2～100倍覺察閾值，并完成標準液的配置[16]。其中，參考本課題組先前研究[17]，確定模擬酒溶液體系為：12%(體積分數)乙醇，0.125 g/L酒石酸及單寧混合溶液，pH調至3.5左右(對照組溶液不添加單寧，實驗組單寧含量2 g/L)，在此基礎上添加香氣化合物。對配制好的標準溶液依次稀釋，每種香氣化合物對應6種濃度，稀釋梯度為3倍，其中，1-辛烯-3-醇的稀釋質量濃度范圍為21.14～46 240.00 μg/L，β-大馬酮的稀釋質量濃度范圍為9.56～20 916.00 μg/L，乙酸異戊酯的稀釋質量濃度范圍為0.59～1 285.20 μg/L，1-辛烯-3-酮的稀釋質量濃度范圍為15.97～2 043.70 μg/L，苯甲醛的稀釋質量濃度范圍為258.50～33 088.00 μg/L，香草醛的稀釋質量濃度范圍為0.95～2 068.00 μg/L。參考PICKERING等[18]的實驗方法，規定評估員的答復呈現在備好的紙質表格上，在品評結束后收集。在每一組中，品評員被要求按照所給的順序聞到每個樣品，圈出與其他2個樣品不同的代碼。對于前鼻閾值評估，每組樣品之間有3 min的休息時間。鼻后閾值評估中，品評員需要戴上鼻夾，將樣品放入口中10 s后再吐出進行評估，每組之間需要飲水清潔口腔，同前鼻評估相同休息3 min，以減少攜帶效應[19]。

1.3 數據處理

數據處理參照美國材料與試驗協會標準[20]，采用BETs。組檢測閾值為各個評估員個人檢測閾值的幾何平均值，每個評估員的個人檢測閾值與組檢測閾值按公式(1)(2)計算[21]：

(1)

(2)

除此之外，倍數變化值(fold change，FC值)則用于表征加入單寧前后的閾值變化倍數。

2 結果與分析

2.1 前鼻閾值

將15名品評員的記錄結果進行了相關計算處理，前鼻閾值結果見表2。6種重要香氣化合物未經單寧處理的前鼻閾值與已有的相關研究結果基本一致。其中β-大馬酮在12%乙醇-水體系中得到的前鼻閾值為7.2 μg/L，與之前報道相似[22]。LORRAIN等[10]測定的12%乙醇-水體系中乙酸異戊酯前鼻閾值為35和46 μg/L (重復組)，本研究得到的閾值結果(39.6 μg/L)也與之基本一致。而加入單寧后，6種香氣化合物的前鼻閾值均有不同程度的增大，其中β-大馬酮(從7.2 μg/L增加到25.4 μg/L)和香草醛(從35.5 μg/L增加到296.9 μg/L)變化最明顯。先前研究發現，多酚主要通過疏水驅動力機制作用于香氣化合物分子，從而導致香氣釋放減少[23]，而香草醛和β-大馬酮都具有環狀結構，但其中香草醛含有苯環結構，多酚沒食子酰基環與芳香環之間的π-π堆積作用可能導致香氣釋放減少[7]，因此香草醛的前鼻閾值在添加單寧后明顯增大。另外，可以看出，同有芳香環結構的香草醛和苯甲醛閾值變化程度具有較大差異，推測單寧與香氣化合物相互作用取決于化合物本身的性質，除疏水性外，化合物的其他物理化學性質也會影響，例如極性[24]。

表2 香氣化合物的前鼻閾值Table 2 The odor thresholds for aroma compounds

2.2 鼻后閾值

不同食品體系下香氣化合物的鼻后閾值存在較大差異(表3)，同時目前對不同體系下香氣化合物鼻后閾值的相關研究也較少，尤其是葡萄酒體系，因此未找到直接相關文獻報道進行比較。從本研究結果來看，在加入單寧后，乙酸異戊酯的鼻后組閾值基本不變；1-辛烯-3-醇、香草醛的鼻后組閾值均增大；而1-辛烯-3-酮、β-大馬酮、苯甲醛的鼻后組閾值均減小。VENUGOPAL等[25]的研究證實不同植物來源的單寧可改變葡萄酒的風味，從本研究中單寧對香氣化合物鼻后閾值的影響來看，可以一定程度上佐證上述研究結果。而除了單寧本身的作用外，單寧與唾液蛋白會形成復合物，將香氣分子保留在疏水腔中，進而改變香氣釋放[26]，這可能是造成1-辛烯-3-醇、香草醛鼻后閾值增大的原因。另外，在葡萄酒飲用過程中存在大量的感知相互作用現象，因此不能忽略單寧帶來的苦澀感對鼻后香氣感知的影響。特別是已經有報道表明揮發性化合物同樣會改變酚類物質的澀感強度[27]。因此，不同香氣化合物對單寧苦澀感的改變可能會造成評價員對差異性樣品的選擇，導致鼻后檢測閾值的變化。

表3 香氣化合物的鼻后閾值Table 3 The retronasal thresholds for aroma compounds

2.3 前后鼻閾值間差異

進一步比較了前后鼻閾值的差異，并利用箱線圖將這種差異呈現出來，結果如圖1所示。其中，差異程度用“*”表示，符號的數量越多，差異性越強。可以看出，在模擬酒溶液中，化合物鼻后閾值通常大于前鼻閾值。單寧會改變苯甲醛與香草醛前后鼻閾值間的差異，而1-辛烯-3-酮、β-大馬酮、乙酸異戊酯這3種化合物在加單寧前后的前后鼻閾值上均體現出了很強的差異性，口腔生理參數對這3種化合物的香氣釋放或感知過程有著較大影響。

ODT-未加單寧前鼻閾值；RDT-未加單寧鼻后閾值；ODT-T-加單寧前鼻閾值；RDT-T-加單寧鼻后閾值；NS-不顯著圖1 香氣化合物閾值箱線圖Fig.1 Threshold boxplot of aroma compounds

2.4 前后鼻閾值變化程度

最后，將每種香氣化合物加入單寧前后的閾值進行了比較，并將比較情況表現在了變化差異的FC值柱狀圖中，為了直觀表示，對變化倍數的數據做了log2(FC)處理。結果如圖2所示。

ODT-前鼻閾值；RDT-鼻后閾值圖2 FC值柱狀圖Fig.2 Bar chart of FC values

在單寧影響下，β-大馬酮、香草醛的前鼻閾值與1-辛烯-3-酮、苯甲醛、香草醛的鼻后組閾值變化更為顯著。總而言之，單寧可以改變香氣化合物的前后鼻閾值。但值得注意的是，單寧對相同化合物前后鼻閾值的影響具有明顯差異，這是由體內外環境的巨大差別導致的，尤其是在體內環境中所涉及的大量生理因素的影響，以及感知相互作用的影響。這其中所涉及的多種分子作用機制，仍需要進一步的探索。

3 結論與討論

本研究由15名經過篩選與訓練的品評員，采用國際標準3-AFC法，分別在有無單寧的情況下，對葡萄酒中6種重要香氣化合物進行前后鼻閾值測定。結果顯示：在單寧影響下， 1-辛烯-3-酮、β-大馬酮、苯甲醛、香草醛這4種香氣化合物的前鼻閾值均增大；1-辛烯-3-醇、乙酸異戊酯的前鼻閾值基本不變；1-辛烯-3-醇、香草醛的鼻后閾值增大；1-辛烯-3-酮、β-大馬酮、苯甲醛的鼻后閾值降低；乙酸異戊酯的鼻后閾值基本不變。

單寧對本研究中的6種香氣化合物的前鼻和鼻后閾值影響各有差異，這與單寧和香氣化合物的復雜作用機制有關。單寧與香氣化合物可以通過疏水作用機制和π-π堆積作用機制，顯著影響了香氣的釋放。同時也有研究表明，雖然單寧可以減少葡萄酒飲用過程中的大部分香氣釋放，但對有些香氣釋放的影響并不顯著[28]，并且，香氣釋放的變化也不一定會引起感官上的變化[17]。除此之外，單寧對相同化合物的前后鼻閾值影響有明顯差異，單寧和口腔生理因素之間的相互作用對香氣釋放的影響可能是葡萄酒消費過程中變化差異的關鍵[1]。有研究推測，單寧與唾液蛋白形成的聚合體的空腔結構可能封存香氣化合物，從而導致香氣釋放減少[26]。本研究初步探索了單寧對葡萄酒重要香氣化合物前鼻和鼻后閾值的影響，也為深入解析單寧對葡萄酒香氣前后鼻感知的影響規律及機制提供了一定的數據支撐和理論依據。