乳酸菌附屬發酵劑的篩選及其對干酪漿蛋白水解的影響

李春燕，熊智強，王光強，宋馨，楊昳津，張匯，艾連中，夏永軍

(上海理工大學 健康科學與工程學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

天然干酪的成熟即通過微生物和酶的作用，使干酪中原有的大分子物質逐步分解并產生豐富的風味化合物及前體物質，賦予干酪以色澤、質地和風味[1]。然而，干酪成熟是一個較長的過程，恒溫恒濕的后熟條件需要大量成本投入，此外，由于標準化生產，巴氏殺菌后的原料乳制得的干酪缺乏傳統干酪的香味，這可能是和非發酵劑乳酸菌(non-starter lactic acid bacteria，NSLAB)數量的減少和重要酶的失活有關[2]。在加工過程中添加NSLAB作為附屬發酵劑來豐富干酪的風味并加速成熟是目前較為常見且有效的方法。

NSLAB主要是通過提升相關酶的含量來加速蛋白質和脂肪的代謝，促進小分子肽、游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)和游離氨基酸(free amino acid，FAA)的生成，以提升干酪風味、縮短成熟時間[3]。此外，對功能食品日益增長的需求推動了益生菌干酪的開發。研究表明，乳酸菌作為附屬發酵劑應用于干酪加工中，不僅可以增強干酪的風味，而且還具有抗氧化、抗高血壓等活性功能[4]。

NSLAB菌株的特異性、發酵劑和NSLAB之間菌群的相互作用都會導致產品特性的差異[5]。此外，NSLAB作為附屬發酵劑在加速干酪成熟過程中，能夠在釋放功能性活性肽的同時，減少苦味肽的生成，從而改善干酪的口感與風味。本研究通過對24株LAB菌株進行特性研究、篩選，然后利用干酪漿模型快速評價NSLAB對干酪蛋白的水解特性，以考量NSLAB在干酪環境中作為附屬發酵劑的實際可行性，為改善天然干酪成熟特性的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

24株LAB，由本實驗室前期分離；生牛乳，光明乳業股份有限公司；CHOOZIT MA 14 LYO發酵劑(乳酸乳球菌乳酸亞種，乳酸乳球菌乳脂亞種)、Marzyme 150 MG凝乳酶，丹尼斯克(中國)有限公司；L-亮氨酸對硝基苯胺，探索平臺；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

KBF240型培養箱，德國Binder公司；Bag Mixer?400均質機，法國interscience公司；PB-10型pH計，瑞士梅特勒-托利多公司；Foss 8400全自動凱氏定氮儀，瑞典FOSS分析儀器有限公司；多功能酶標儀，美谷分子儀器限公司；Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株和培養條件

本研究中使用的24株LAB的菌株信息如表1所示。將菌株在MRS培養基中37 ℃連續傳代2次。

表1 本研究中所用乳酸菌的種類、菌株編號及來源Table 1 Species, strain ID, and sources of LAB strains used in this study

1.2.2 附屬發酵劑的篩選

1.2.2.1 產酸能力

將24株LAB按照1%的接種量分別接種于10%質量分數的脫脂乳培養基中，在30 ℃下培養，分別測定培養0、6 和24 h后的培養基pH值[6]。

1.2.2.2 自溶度

參考SCATASSA等[7]的方法測定自溶度。

1.2.2.3 氨肽酶活力測定

(1)細菌無細胞提取液(cell-free extract，CFE)的制備。制備方法參考文獻[8]。

(2)酶活力測定。參考文獻[9]的方法。氨肽酶活力：在37 ℃條件下，在410 nm下、1 min使吸光度改變0.001個單位所需酶的數量為1 U。結果表示為U/mg蛋白質。

1.2.2.4 蛋白水解活性

將菌株點接在含1%脫脂乳粉的PCA培養基上，37 ℃培養48 h[10]。選擇有透明圈形成的陽性菌株測定其蛋白水解度。

使用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)試劑法測定菌株的蛋白水解活性[11]。根據酪氨酸標準曲線，以水解產生的相當于酪氨酸的FAA的量表征蛋白水解度。

1.2.2.5 脂解活性

將菌株點接在含0.1%三丁酸甘油酯的MRS培養基上，37 ℃培養72 h，觀察有無透明圈形成[1]。

1.2.2.6 耐鹽性和產胞外多糖情況

在含有2%、4%、6% 質量分數NaCl的液體MRS中分別接種24株LAB，37 ℃培養，分別測定培養液在0和24 h的OD600，以測試菌株的耐鹽性[12]。

用10%的蔗糖代替MRS中的葡萄糖，使用接種環法測試菌株產EPS情況[13]。

1.2.2.7 在低溫條件下的生長情況

將菌株接種于液體MRS中，分別在4、10、15 ℃ 3個溫度條件下培養24 h，通過測定OD600值判斷24株LAB的生長狀況[14]。

1.2.3 干酪凝乳及干酪漿模型的制備

(1)干酪凝乳的制作流程。參考袁然等[15]的方法。

(2)干酪漿模型的制作。將上述干酪凝塊與50 g/L的無菌NaCl溶液按照2∶1的質量比裝入無菌均質袋中，制成對照樣；實驗樣分別加入4種NSLAB菌株的菌懸液(終濃度106CFU/mL)[16]。使用均質機勻漿后，置于30 ℃培養箱中后熟。分別在第0、3、6、9、12天對各組干酪漿進行取樣分析。

1.2.4 不同NSLAB菌株對干酪漿模型的影響

1.2.4.1 干酪漿組分和pH測定

水分：參考GB 5009.3—2016 《食品安全國家標準 食品中水分的測定》；脂肪：參考GB5009.6—2016 《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》；蛋白質：參考GB5009.6—2016 《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》，使用Foss 8400全自動凱氏定氮儀測定；pH：將干酪漿與無菌水按1∶2質量比混勻，用pH計測定pH值。

1.2.4.2 干酪漿模型成熟期間微生物變化情況

在LM17培養基上(30 ℃有氧條件下培養48 h)計數發酵劑乳球菌數；在ROGOSA培養基上(37 ℃厭氧條件下培養48 h)計數總NSLAB數[17]。

1.2.4.3 蛋白水解情況

(1)pH 4.6-SN。取2.5 g干酪漿，加入22.5 mL 0.9%的NaCl溶液中，調節pH值至4.6，在25 ℃水浴1 h后離心，取上清液進行凱氏定氮[18]。

(2)12% TCA-SN。取pH 4.6-SN溶液和24% 三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)溶液各4 mL，混勻后25 ℃水浴1 h，離心、取上清液進行凱氏定氮[19]。

(3)干酪漿模型成熟過程中水溶性多肽的RP-HPLC。取pH 4.6-SN上機分析，RP-HPLC采用梯度洗脫模式，具體條件參照賈宏信等[20]的研究。

1.2.5 數據處理

采用SPSS 17.0、Origin 2019對數據進行處理分析，數據用均值±標準差(n=3)的形式表示。

2 結果與分析

2.1 附屬發酵劑的篩選結果

2.1.1 菌株產酸能力與自溶度評價

在干酪加工中，NSLAB的酸化能力不宜過高，以避免干酪過度酸化。24株LAB的酸化結果如圖1-a所示，根據附屬發酵劑的酸化標準[21]，除了菌株AR93和AR184在6 h后的ΔpH≥0.4，其余菌株的酸化能力均較低；24 h后酸化結果表明，13株菌株在24 h內ΔpH均<1，符合NSLAB篩選條件。

NSLAB菌體裂解并隨后釋放胞內酶能力是干酪成熟過程中一個理想的特性。胞內蛋白酶、脂肪酶等可以促進干酪中小分子物質的生成。如SEIXAS等[12]從手工Serrano干酪中分離出的LeuconostocmesenteroidesUEL28菌株自溶度為11.8%。結果顯示(圖1-b)，42%的菌株具有良好的自溶度(自溶度>25%)，其中，AR809的自溶能力最強，達到52%。根據AYAD等[21]所述標準，除了自溶度<15%的AR243和AR513，其余22株LAB的自溶度均符合篩選條件。

a-酸化能力；b-自溶度圖1 24株LAB的酸化能力和自溶度Fig.1 Acidification and autolysis activities of 24 LAB strains注：a中不同小寫字母表示菌株發酵6 h后的pH值存在顯著差異， 不同大寫字母表示菌株發酵24 h后的pH值存在顯著差異 (P<0.05);b中不同小寫字母表示結果存在顯著差異(下同)

2.1.2 氨肽酶與蛋白水解能力評價

氨肽酶能夠順式水解肽鏈氨基末端的疏水性氨基酸[22]。在附屬發酵劑菌株的篩選研究中，所選菌株的氨肽酶活力在0.1～143 U/mg不等。如GONZLEZ等[8]從傳統西班牙干酪中篩選出的LactobacillusplantarumGE2077酶活力為18 U/mg，酶活力值最高的L.paracaseiGE2036的酶活力為143 U/mg。

本研究中，24株LAB的亮氨酸氨肽酶活性范圍為6.5～55.7 U/mg(圖2-a)，其中AR171、AR184、AR287、AR469、AR497、AR611、AR612、AR809的氨肽酶活力較高，具有作為NSLAB的潛力。

蛋白水解活性是NSLAB作為附屬發酵劑的一項重要特性，適度的蛋白水解可以加速小分子物質的生成。結果表明，24株LAB菌落周圍均有透明圈的形成，選擇陽性菌株進一步測定其蛋白水解度。酪氨酸標準曲線的回歸方程為y=0.0039x+0.0247，R2=0.998 6。如圖2-b所示，菌株的蛋白水解活性在70.59～209.18 mg/L，菌株AR496蛋白水解活力最高，且不同菌株之間的蛋白水解活性存在顯著差異(P<0.05)。在NIETO-ARRIBAS等[6]的研究中，3株LAB候選菌株的蛋白水解活性在90～135 mg/L上下，表明本研究中菌株的蛋白水解活性具備作為NSLAB的應用潛力。

a-氨肽酶活性；b-蛋白水解活性圖2 24株LAB的氨肽酶活性和蛋白水解活性Fig.2 Aminopeptidase and proteolytic activities of 24 LAB strains

2.1.3 脂解活性

在脂肪酶的作用下，甘油三酯可以被水解為單、雙甘油三酯，以及FFA和甘油[23]。結果顯示(表2)，10個LAB菌株具有脂解活性，其中AR809的透明圈比值最大，在干酪生產中有良好應用潛力。

2.1.4 耐鹽性和產EPS情況

在成熟過程中，干酪高鹽的環境要求NSLAB對鹽有一定的耐受性。結果表明(表2)，所有菌株均可以在2%～4%的鹽含量下存活，可作為干酪生產中的附屬發酵劑。

乳酸菌在生長過程中分泌的EPS，可以改善干酪的質地[10]。結果顯示，有8株LAB可以產生EPS。

2.1.5 低溫條件下的生長情況

如表2所示，50%的LAB可在4 ℃下存活，但是生長情況不佳。隨著溫度的提升，所有菌株在10和15 ℃條件下的OD600值均增加，表明菌株可在此溫度下生長。在干酪成熟過程中，環境溫度普遍在10 ℃上下，這表明所選24株LAB均符合NSLAB菌株的篩選標準。

表2 LAB菌株的耐鹽能力、低溫條件下生長情況、 產胞外多糖和脂解能力Table 2 Salt tolerance, cold resistance, EPS and lipolytic activities of LAB

綜合上述篩選指標，選擇了4株具有良好應用潛力的菌株：AR497、AR611、AR612、AR809。上述菌株具有低產酸能力、高自溶度和氨肽酶活力、具有適度蛋白水解活性、能夠適應干酪后熟過程中的高鹽低溫環境。將4株菌添加到干酪漿模型中，快速考量各菌株對干酪成熟特性的實際影響。

2.2 四種乳桿菌對干酪漿模型的影響

2.2.1 干酪漿組分和pH結果分析

取成熟12 d的干酪漿進行成分分析，結果表明(表3)，分別添加4種附屬發酵劑的實驗組與對照相比，其脂肪、蛋白質和水分含量均無明顯差別(P>0.05)，即附屬發酵劑的添加不會改變干酪的總成分。

表3 干酪漿組成分析 單位：%

由圖3所示，在成熟過程中，干酪漿pH呈先下降、后略升高，最后趨于穩定的趨勢。在成熟過程中，4個實驗組和對照組的pH變化未見顯著差異(P>0.05)，表明4株NSLAB菌株的加入對模型體系的pH無負面影響。

圖3 干酪漿模型成熟期內的pH變化Fig.3 Changes in pH of cheese slurry model during ripening

2.2.2 干酪漿模型成熟過程中的微生物變化情況

如圖4-a所示，在對照組和實驗組中，發酵劑乳酸菌濃度變化趨勢基本相同，在第12天時基本都維持在106CFU/g干酪漿，這些結果表明，NSLAB的加入對發酵劑的存活無明顯影響。

a-乳酸乳球菌菌落數；b-附屬發酵劑菌落數圖4 干酪漿模型成熟過程中發酵劑乳球菌和 附屬發酵劑的變化情況Fig.4 Changes of Lactococcus starters and adjunct cultures of cheese slurry model during ripening

如圖4-b所示，對照組和實驗組中附屬發酵劑NSLAB的初始濃度約為106CFU/g干酪漿，在0～3 d內增加到107～108CFU/g；隨后可能由于菌體發生了自溶，菌落濃度略有下降；在12 d的成熟時間內總體趨于穩定且菌落數保持在較高水平。在對照組中，NSLAB的數量從第0天時未檢出，增加到成熟第12天時的104CFU/g。由于制作和取樣過程均在無菌操作臺上完成，盡可能避免外界污染，因此，這種結果可能是由于不定形NSLAB的形成造成[17]。

2.2.3 蛋白水解

(1)pH 4.6-SN、12% TCA-SN。pH 4.6-SN可代表初級蛋白水解。如圖5-a所示，隨著后熟過程進行，5組模型組的pH 4.6-SN含量都在不斷增加，在成熟第6天時，4組實驗組的pH 4.6-SN含量均高于對照組。第12天的方差分析表明，AR809和AR611兩組的pH 4.6-SN含量與對照相比具有顯著性差異(P<0.05)。

12% TCA-SN可作為二次蛋白水解程度的指標。由圖5-b可看出，試驗組的12% TCA-SN含量均高于對照組，且AR809組含量最高。這可能由于AR809自溶釋放出更多胞內氨肽酶等，促進了小分子物質的生成。不同菌株對干酪漿二次蛋白水解的影響各不相同，這可能是由于它們在干酪基質中實際酶活性的差異性所致。

a-pH 4.6-SN含量；b-12% TCA-SN含量圖5 干酪漿模型成熟過程中蛋白質降解Fig.5 Degradation of protein during ripening cheese slurry model

(2)干酪漿模型成熟過程中水溶性多肽的RP-HPLC。以AR809和對照組的RP-HPLC結果為例(圖6)，在第0天時，干酪漿中的親水性肽(11.2～21.9 min洗脫)和疏水性肽(21.9～69 min洗脫)的峰區相似；隨著后熟的進行，親水性多肽的種類和含量呈增加趨勢；第12天時，對照組和4個實驗組的圖譜出現差異，其中含L.salivariusAR809的實驗組與對照相比，峰數和峰面積更多，表明干酪中酪蛋白的二次水解受到NSLAB的影響。

a-第0天；b-第6天；c-第12天圖6 干酪漿模型成熟0、6、12 d后水溶性組分肽的RP-HPLCFig.6 RP-HPLC of water-soluble fraction cheese slurry model after 0, 6 or 12 d ripening

此外，前期的研究表明，AR809可以通過激活icaR基因和抑制icaA基因的表達來抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生物膜的形成，從而有效緩解S.aureus引起的咽炎[24]。將AR809作為干酪成熟過程中的附屬發酵劑，可能是將益生菌引入人體的一種實用途徑。

3 結論

本研究通過對24株LAB的菌株特性進行評估，篩選出4株具有應用潛力的NSLAB菌株；然后以干酪漿為快速成熟模型，評估NSLAB在復雜的干酪環境中的促熟作用。結果表明，NSLAB的加入均可促進酪蛋白的水解，但不同菌株具有不同的水解能力，L.salivariusAR809的促進作用最為明顯。這可能是由于干酪中微生物的相互作用或AR809能夠更好地適應干酪環境，促使AR809釋放更多與蛋白水解相關的酶，進一步促進水溶性肽等低分子物質的產生。研究結果表明，AR809 具有作為附屬發酵劑應用于干酪生產的潛力。此外，益生菌強化食品對人類健康有積極影響，AR809作為1株具有緩解咽炎功能特性的益生菌，對人體健康具有積極作用。

本實驗所用的干酪漿模型，其組成和質地與天然干酪相似，但具有較高的含水量和成熟溫度，因此可加快體系內的生化反應，從而可以對NSLAB的作用進行快速評估。在接下來的研究中，還需進一步研究L.salivariusAR809在干酪成熟過程中的實際促熟作用，并研究AR809對干酪益生功能特性的影響。