基于分子感官和穩定性評價戊糖乳桿菌AB-8對薏仁米的發酵過程

陳樂樂，史海波，申芳嫡，吳雋愷

1(寧波職業技術學院 化學工程學院，浙江 寧波，315800)2(寧波大學 食品與藥學學院，浙江 寧波，315800)

分子感官科學是在分子水平上定性和定量解析食品的滋味和氣味等感官品質的多學科交叉綜合技術，由德國Peter Schieberle教授于2007年提出[1-2]。其主要以GC-MS、氣相色譜-嗅聞儀(gas chromatography-olfactometry, GC-O)和核磁共振等高靈敏的檢測分析方法為技術基礎，從分子水平解密食品滋味和風味的物質組成，客觀評價食品的感官品質[2]。近幾年科學家們利用分子感官科學技術著重對各種發酵食品及果蔬汁中滋味和風味物質的組成進行相應研究。RHYU等[3]根據分子感官技術鑒定出鮮味肽(含谷氨酸或天冬氨酸)是決定大醬鮮味的主要物質之一。而甲硫氨酸、麥芽酚、愈創木酚、4-乙基愈創木酚、2-乙酰吡咯、2-乙酰呋喃、2-苯乙醇和4-羥基-2, 5-二甲基-3(2H)-呋喃酮是我國市售醬油的主要呈味物質，使醬油具有烤土豆味、焦糖味、烤堅果味和水果味等特征[4]。此外，ZHANG等[5]利用GC-MS和GC-O聯用技術鑒定出18種具有香氣活性的紅樹莓汁揮發性化合物，發現花草香是紅樹莓汁的主體香氣。

薏仁米，又稱薏米，是一年生禾本科草本植物薏仁的種仁，營養豐富且兼具藥理作用，具有利尿、抗過敏、抗炎、抗肥胖、抗氧化和免疫調節等多種功效，被譽為“生命健康之禾”[6-9]。大量研究表明，薏仁米作為一種高油脂的谷物，極易在貯藏過程中發生酸敗而導致劣變[10]，嚴重限制了其營養及開發價值，因此對薏仁米深加工開發具有重要意義。

近年來，乳酸菌發酵已成為谷物深加工中最經濟和安全的技術之一。在谷物發酵過程中，乳酸菌的生長代謝與谷物成分相互作用，增強纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶等相關酶的表達，改善發酵谷物產品的理化特性和感官品質[11]。YIN等[12]研究發現植物乳桿菌NCU137發酵薏米能顯著增加醇類化合物和減少呋喃類化合物的含量。戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)AB-8是一株從四川泡菜中分離出的潛在益生菌，其生長速率快，耐酸和產酸能力強，還具有較強的產β-葡萄糖苷酶能力。因此，本研究基于分子感官和穩定性評估戊糖乳桿菌AB-8對薏仁米的發酵影響，測定發酵過程中有機酸、氨基酸和揮發性風味物質的變化，并結合人工感官和穩定性測試評價乳桿菌AB-8的發酵性能，為改善薏仁米感官品質提供數據支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：薏仁米，長春金籽農產品有限公司；戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)AB-8，實驗室分離獲得。

試劑：亞鐵氰化鉀、ZnSO4、茚三酮、NaCl等(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；草酸、乳酸、丁酸、蘋果酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、2-辛醇等(色譜純)，上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16M臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；1260高效液相色譜儀、7890A氣相色譜儀、5975C質譜儀，美國Agilent公司；LA-8080全自動氨基酸分析儀，日本日立制作所；LT3600 ZETA電位分析儀，上海力晶科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

參考YIN等[12]的方法制備發酵薏仁米。稱取新鮮薏仁米300 g，加水浸泡4 h，用2倍質量的無菌水打漿，打漿的混合物置于115 ℃滅菌20 min，冷卻后裝入無菌玻璃罐中，混勻后接種于戊糖乳桿菌AB-8 3.8×105CFU/g混合物，37 ℃發酵48 h，每12 h平行取樣3次，并編號為0、12、24、36、48 h，置于-80 ℃冰箱儲存，待測。

1.3.2 有機酸測定

采用HPLC檢測薏仁米發酵過程中有機酸的含量[13]。稱取適量樣品，8 000 r/min離心15 min取上清液，依次加入等體積的亞鐵氰化鉀和ZnSO4，混勻，12 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm濾膜后進行HPLC分析。色譜條件：Ecosil C18色譜柱，流動相為甲醇-水-磷酸溶液[A液，V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=80∶15∶5；B液，V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=5∶90∶5]，流速0.5 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm；梯度洗脫：0～5 min，B 100%；5～15 min，B 100%～90%；15～45 min，B 90%～0%；45～55 min，B 0%；55～60 min，B 0%～100%；60～70 min，B 100%[13]。

1.3.3 游離氨基酸測定

參考王澤晗等[14]的方法測定。稱取適量樣品，8 000 r/min離心15 min取上清液，加入4倍體積的50 g/L三氯乙酸溶液，混勻后4 ℃反應60 min，10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜后進行游離氨基酸分析。分析條件：分離柱為TS263離子交換柱，流速60 μL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長為440和570 nm。

1.3.4 揮發性風味化合物測定

參照楊忠全等[15]的方法測定。稱取2 g樣品置于20 mL螺口頂空瓶中，分別加入6 mL超純水和1.5 g NaCl，再向瓶內加入10 μL 2-辛醇(1.6 g/L)標準品作為內標物，密封后置于60 ℃水浴平衡5 min，將萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)插入頂空瓶吸附40 min，然后在GC進樣口(250 ℃)解吸5 min。GC條件：采用Agilent DB-WAX毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃，不分流；載氣為氦氣；流速1.0 mL/min；升溫程序：初始40 ℃保持2 min；以4 ℃/min上升到80 ℃，保持2 min；以4 ℃/min上升到145 ℃；再以10 ℃/min上升到220 ℃；保持5 min。質譜條件：電子轟擊離子源；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度180 ℃；掃描范圍m/z33～450。定性方法：經NIST08數據庫檢索定性。采用面積歸一法定量[15]。

1.3.5 感官評定

參考ISO 8589—2010《感官分析 試驗室設計的一般指南》對發酵前后樣品進行感官評價。感官評價小組由12位品評師(6男6女，年齡25～45歲)組成，試驗在食品感官品評室中進行。參考標準物質的溶度參照STEINHAUS等[16]的方法。以下5種水溶液作為“滋味”標準：2 g/L NaCl(咸味)、1.65 g/L乳酸(酸味)、5 g/LL-異亮氨酸(苦味)、35 g/L 蔗糖(甜味)和0.6 g/L谷氨酸鈉(鮮味)。同時，以下6種水溶液作為“風味”標準：乙酸(酸香)、1-辛烯-3醇(蘑菇香)、苯乙醇(花香)、乙醇(醇香)、己酸乙酯(果香)和己醛(脂肪香)，然后被要求對樣品滋味和氣味強度進行評分(0～9)：0(無)；1～3(較弱)；4～6(中等強度)；7～9(強)。

1.3.6 穩定性測定

采用電位分析儀表征發酵前后薏仁米樣品的粒徑和ζ電位。

1.4 數據分析

數據結果以平均值±標準偏差的形式表示。使用SPSS 19.0軟件進行方差分析。采用GraphPad Prism 8.0、Excel 2017和R 3.6繪制圖表。

2 結果與討論

2.1 發酵對有機酸含量的影響

乳酸菌可將薏仁米中小分子糖類物質轉化為有機酸，增加產品酸感。發酵后的薏仁米有機酸色譜圖見電子增強出版附圖1(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032010)。由表1可知，在未發酵樣品中只檢測到草酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和α-酮戊二酸等5種有機酸，其含量分別為94.36、214.11、37.45、26.84、8.22 mg/L。接種戊糖乳桿菌AB-8后，除蘋果酸含量逐漸減少外，其他有機酸均逐漸增加。在發酵48 h時草酸、檸檬酸、琥珀酸和α-酮戊二酸分別比未發酵增加了10.81%、2 513.94%、96.13%和57.91%，而蘋果酸含量則減少了72.27%。此外，在發酵48 h時還檢測到乳酸、丁酸和乙酸，其含量分別為3 412.67、535.73、283.5 mg/L，而乳酸作為乳酸菌的主要代謝產物，占有機酸總含量的62.73%。在乳酸發酵體系中生成的乳酸可以參與丁酸和揮發性脂類化合物的合成[17]。丁酸是一種常見的短鏈脂肪酸，可用于改善非酒精性脂肪肝的形成[18]。綜上可知，接種戊糖乳桿菌AB-8發酵可賦予薏仁米柔和的酸感，并提升薏仁米的益生功能。

表1 薏仁米發酵過程中有機酸含量的動態變化Table 1 Dynamic changes of organic acids content during the fermentation of coix seed

2.2 發酵對游離氨基酸含量的影響

乳酸菌發酵谷物過程中可利用其自身蛋白水解系統降解谷物蛋白生成短肽和氨基酸，賦予產品獨特的鮮味特征[20-21]。發酵后的薏仁米游離氨基酸色譜圖見電子增強出版附圖2(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032010)。根據表2可知，在未發酵樣品中只檢測到6種游離氨基酸和2種必需氨基酸，含量最高的為Arg(6.89 mg/L)，其次分別為His(6.57 mg/L)、Pro(3.86 mg/L)、Lys(3.62 mg/L)、Ala(3.39 mg/L)和Gly(1.41 mg/L)，與YIN等[12]的研究結果相一致。接種戊糖乳桿菌AB-8后，薏仁米中游離氨基酸的組成發生顯著改變，其游離氨基酸和必需氨基酸種類分別增加至17種和8種。在發酵48 h時總氨基酸含量和必需氨基酸含量分別比未發酵增加了3.72倍和5倍。除Pro和Arg外，其他氨基酸含量均隨發酵的不斷進行而逐漸增加，其中His、Ala、Val、Phe和Glu等5種氨基酸含量增加最為顯著，在發酵48 h時含量分別可達22.89、19.11、13.04、12.05和9.12 mg/L。某些氨基酸含量的增加可能是由于乳酸菌代謝產生的氨基酸和其他氨基酸的轉化，從而豐富產品的滋味[12]。Asp和Glu有助于改善產品的鮮味，而Ser、Gly、Ala和Thr可賦予產品甜味[22]。以Asp、Glu、Gly和Ala為代表的滋味氨基酸對薏仁米的滋味起著至關重要的作用，發酵48 h時鮮味氨基酸(13.26 mg/L)和甜味氨基酸(25.24 mg/L)含量遠高于未發酵薏仁米(未檢出和12.28 mg/L)。此外，Asp、Glu、Gly和Ala的含量還會影響薏仁米的風味，發酵48 h后薏仁米中風味氨基酸含量可達35.64 mg/L，是未發酵的7.43倍。上述結果表明，戊糖乳桿菌AB-8發酵可提高薏仁米的游離氨基酸含量，增加滋味和風味氨基酸的含量，有助于促進發酵薏仁米鮮甜滋味和風味的形成。

表2 薏仁米發酵過程中游離氨基酸的動態變化Table 2 Dynamic changes of free amino acids during the fermentation process of coix seed

續表2

2.3 發酵對揮發性化合物含量的影響

薏仁米中脂類和含氮化合物可作為大多數揮發性化合物的前體[17]。發酵后的薏仁米揮發性化合物色譜圖見電子增強出版附圖3(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032010)。由電子增強出版附表1可知，在未發酵樣品中檢測出30種揮發性化合物，接種戊糖乳桿菌AB-8發酵48 h后，可檢測出42種揮發性化合物。未發酵和發酵的薏仁米揮發性化合物含量差異顯著，隨著發酵的不斷進行，揮發性化合物含量呈先降后升的變化趨勢。發酵48 h后總揮發性化合物含量可達15 059.58 μg/L，比未發酵增加了36.19%。除醛類和其他類化合物外，醇類、酸類、脂類和酮類化合物的含量均隨發酵的不斷進行而逐漸增加，在發酵48 h時含量分別可達7 134.92、1 552.16、2 019.89、1 921.56 μg/L。其中，乙酸、異丁酸、丁酸、己酸、辛酸和壬酸僅在發酵的薏仁米中被發現，這些物質是潛在的酸化劑同時可作為霉菌的廣譜抑制劑[12]。醇類化合物可為發酵產品帶來酒香氣和怡人的花草香氣[23]，發酵48 h后含量最高的醇類化合物為正己醇(2 916.6 μg/L)，其次分別為正辛醇(820.3 μg/L)和苯乙醇(2 916.6 μg/L)。醛類化合物具有沸點低和閾值小等特性，具有脂肪味、花香、果香和青草香等風味，對薏仁米風味的貢獻較大[12]。發酵48 h后醛類化合物中含量較多有糠醛(616.81 μg/L)、2-辛烯醛(128.1 μg/L)和壬醛(121.04 μg/L)等。經戊糖乳桿菌AB-8發酵的薏仁米中2,3-丁二酮、2-庚酮、3-羥基-2-丁酮和2-壬酮的含量較高，在發酵48 h時含量分別可達176.22、427.14、835.66、241.11 μg/L，而未發酵樣品的檢測結果正好相反。這可能是因為在檸檬酸代謝過程中，檸檬酸被檸檬酸裂解酶分解為乙酸和草酰乙酸，后者經草酰乙酸脫羧酶生成丙酮酸，并降解為乳酸、2,3-丁二酮和3-羥基-2-丁酮[24]，其中，后兩者賦予發酵薏仁米濃郁的奶香味[24]。此外，發酵48 h后2-戊基呋喃(779.93 μg/L)含量顯著低于未發酵樣品(2 614.95 μg/L)。2-戊基呋喃對熱加工食品的感官特性有顯著貢獻，但對人體健康有害[25]。本研究結果表明，接種戊糖乳桿菌AB-8發酵可增加薏仁米揮發性風味物質的含量，使發酵后薏仁米具有特殊香氣。此外，發酵有助于減少2-戊基呋喃和糠醛的含量，提高產品的安全性。

2.4 發酵對關鍵滋味及香氣化合物的影響

滋味活性值(taste activity value, TAV)和香氣活性值(odor activity value, OAV)能確切地評價單一組分的滋味和香氣強度對整體滋味和香氣的貢獻度。通常認為TAV>1的化合物為呈味的關鍵化合物，而OAV>1的化合物則為呈香的關鍵化合物[5, 22]。根據表1、表2及增強出版表1可知，以TAV>1或OAV>1為標準在薏仁米發酵過程中篩選出22種關鍵滋味化合物和19種關鍵香氣化合物。基于這些關鍵化合物對15個樣品進行層次聚類。如圖1-a所示，這些樣品可被劃分為2個簇，未發酵樣品單獨聚為1簇(Ⅰ)，其他發酵樣品則聚為另一簇(Ⅱ)；而第Ⅱ簇又可進一步分為兩個亞簇，其中發酵12～24 h的樣品聚為一個亞簇(ⅰ)，發酵36～48 h的樣品則聚為另一個亞簇(ⅱ)。不同發酵時間的樣品中關鍵滋味和風味物質呈現清晰的時間變化規律。此外，在主成分分析中也觀察到與聚類分析相一致的結果(圖1-a)。由圖1-b可知，主成分1表示所有變量的84.77%，主成分2表示所有變量的8.91%，總計貢獻率達93.68%。上述結果表明，接種戊糖乳桿菌AB-8發酵能夠改變薏仁米中關鍵滋味和風味物質的含量。

a-聚類分析；b-主成分分析圖1 發酵對關鍵滋味和香氣化合物的影響。Fig.1 Effect of fermentation on key flavor and aroma compounds

2.5 不同發酵時間標志性關鍵滋味和香氣化合物的分析

為進一步確定不同發酵時間的標志性關鍵滋味和香氣化合物，對薏仁米發酵過程進行了線性判別分析效應大小分析。由圖2可知，未發酵、發酵12～24 h和發酵36～48 h薏仁米分別鑒定出16、11和14個關鍵物質。1-辛烯-3-醇、己醛、Arg、Lys、草酸和蘋果酸等在未發酵薏仁米中富集；2-壬酮、2,3-丁二酮、Asp、Glu、琥珀酸和檸檬酸等在發酵12～24 h薏仁米中富集；而己酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、Tyr、Val、丁酸和乳酸等在發酵36～48 h薏仁米中富集。1-辛烯-3-醇呈現強烈的蘑菇香[4]，可能是薏仁米中蘑菇香的特征物質；而己醛等醛類化合物具有脂肪味，可能是薏仁米中脂肪香的特征物質。己酸乙酯等酯類化合物可能來源于醇類化合物和酸類化合物的酯化反應，其呈現果香，使發酵后的薏仁米具有果香特征。

圖2 不同發酵時間生物標志性關鍵滋味和 香氣化合物的分析Fig.2 Analysis of key taste and aroma compounds of biomarkers at different fermentation times

2.6 發酵對感官評定的影響

如圖3所示，薏仁米發酵前后在不同感官屬性上的強度值及其風味均存在差異。接種戊糖乳桿菌AB-8發酵48 h后，酸味、甜味、苦味及鮮味顯著高于未發酵樣品。未發酵樣品的脂肪香和蘑菇香顯著高于發酵48 h樣品，而果香和花香則顯著低于發酵48 h樣品。綜上可知，發酵48 h薏仁米的滋味以酸味、甜味和鮮味為主，而香氣則以果香和花香最為突出。

a-滋味；b-香氣圖3 發酵對感官評定的影響Fig.3 Effect of fermentation on sensory evaluation注：*表示差異顯著(P<0.05)

2.7 發酵對穩定性的影響

如圖4-a所示，未發酵樣品靜置1 h后出現明顯的分層，而接種戊糖乳桿菌AB-8發酵48 h后的樣品穩定性較好。為確定影響薏仁米穩定性的因素，對薏仁米的ζ電位和粒徑進行了檢測。由圖4-b和圖4-c可知，接種戊糖乳桿菌AB-8發酵48 h后，發酵薏仁米的ζ電位絕對值從9.16 mV顯著減小至1.13 mV，而粒徑則從1 020 nm增加至5 116 nm。根據靜電原理[26]，由于ζ電位絕對值的降低和粒徑的增大，發酵48 h后顆粒運動速度比未發酵樣品要慢。這些結果表明，接種戊糖乳桿菌AB-8發酵可以提高薏仁米的粒徑和降低ζ電位絕對值，降低顆粒沉降速度，從而增加薏仁米的貯藏穩定性。

a-穩定性；b-ζ電位；c-粒徑圖4 發酵和未發酵薏仁米的穩定性、ζ電位和粒徑的比較Fig.4 The comparison of the stability,ζ potential, and particle size between fermented and non-fermented coix seed注：** P< 0.01，*** P< 0.001

3 結論

本文將戊糖乳桿菌AB-8用于薏仁米發酵，研究發酵過程中有機酸、游離氨基酸和揮發性風味物質等分子感官指標的變化規律，并比較發酵前后的人工感官及穩定性的差異。結果表明，發酵能顯著提高薏仁米的有機酸含量，其中乳酸的含量變化最大，增加了3 412.67 mg/L。相比未發酵樣品，發酵48 h后總氨基酸含量和必需氨基酸含量分別增加了3.72倍和5倍。此外，接種戊糖乳桿菌AB-8發酵后薏仁米揮發性風味化合物的種類從30種增加至42種，含量則從11 057.82 μg/L 增加至15 059.58 μg/L。發酵48 h后可顯著增加薏仁米的酸味、甜味和鮮味，同時增加果香和花香。此外，發酵還可以改善薏仁米的穩定性。本研究為薏仁米發酵加工提供了實驗依據，為薏仁米的深加工提供了一種新型環保的加工工藝。