美拉德反應制備雞肉風味基料工藝優化及呈味特性分析

侯鈺柯，蔣宇飛，康明麗，李凌云，韓敏義,*，徐幸蓮

1(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)2(農業部肉品加工重點實驗室 江蘇省肉類生產與 加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京，210095)3(溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮，527400) 4(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊，050018)

一般傳統雞湯熬制通過熱反應使雞肉風味物質轉移至水中，并將蛋白質水解成氨基酸，所熬制的雞湯風味鮮美[1]，但是這種方式消耗大量能量，成本較高。一些餐飲業使用雞肉風味基料替代雞湯經過長時間熬制產生的雞肉香味，但是多數雞湯風味模擬性較差，可能是因為企業為了降低成本使用了植物蛋白風味基料[2]，與雞肉風味相似度不高。

研究發現，雞骨架作為雞肉分割生產的副產物，蛋白質和呈味氨基酸含量高于雞肉，有較高的營養價值，具有作為風味基料的潛力[3]。利用雞骨架酶解產物進行美拉德反應制備雞肉風味基料，可以使雞肉本身的風味物質得到表達，同時對低附加值產品雞骨架進行利用，降低了生產成本。于亞輝等[4]以雞肉酶解液為反應基底，探究制備風味基料的最優條件，得到的產物色澤均勻、肉香味突出；曾曉房[3]以雞骨架酶解液為原料，優化了制備雞肉風味基料的條件，研究了酶解肽在反應中的降解、酶解程度以及肽段組分對肽降解的影響及其內在關系。工業生產通過酶解和美拉德反應制備風味基料的研究大都是探究反應的最佳條件，對美拉德反應前后的呈味特性分析少見報道。

因此，本研究對雞骨架進行酶解，以酶解液為原料，探究pH、溫度和時間對褐變程度、低分子香味中間體生成量和感官評價的影響，通過Box-Behnken響應面優化反應條件。對反應前后的滋味、氣味、游離氨基酸和揮發性風味物質含量進行分析，以期利用雞骨架制備風味基料，為雞肉分割副產物的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃羽肉雞雞骨架取自新興縣溫氏佳豐食品有限公司雞肉分割生產線，肉雞品種為818肉雜雞，日齡52 d左右，母雞，取樣時間為宰后1～2 h。

風味蛋白酶(酶活力30 000 U/g)，金克隆生物技術有限公司；NaOH等試劑均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器

HWS-26 電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；MS304TS/02電子天平、S2-Food Kit型pH計，瑞士梅特勒托利多公司；Allegar-64R 型低溫離心機，美國貝克曼庫爾特公司；PD500高速均質機，普律瑪儀器有限公司；DH-9240A烘箱，上海浦東榮豐科學儀器有限公司；INFINITE 200 PRO酶標儀，瑞士帝肯公司；LC-20AT 高效液相色譜儀，島津公司；LDZH-200KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；FlavourSpec?氣相離子遷移譜儀，德國GAS公司；SA-402B 電子舌，日本INSENT公司；PEN3便攜式電子鼻，德國埃爾森斯檢測公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解液的制備

參考張恒[5]的方法并做適當修改。將雞骨架洗凈、瀝干、絞碎成雞骨泥，加入一定量的去離子水調節蛋白濃度為5%(蛋白質濃度用凱氏定氮法測量)，用勻漿機勻漿(10 000 r/min, 20 s×3)，經加熱預處理10 min，加入風味蛋白酶7 000 U/g，調節pH為7，置于恒溫水浴(50 ℃)中酶解4 h，酶解結束后沸水浴10 min滅酶，此時具有最高的水解度和氮回收率，分別達到33.54%和96.20%。冷卻后離心(3 580×g，10 min)，上清液即為酶解液。

1.3.2 雞骨架美拉德反應產物(Maillard reaction products, MRPs)的制備

參考曾曉房[3]的方法并做適當修改，取50 g雞骨架酶解液，加入水解植物蛋白10 g(游離氨基酸含量為2 932.5 mg/g)，葡萄糖1.5 g，木糖1.5 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.6 g，甘氨酸0.4 g，丙氨酸0.4 g，維生素B10.75 g，雞脂2 g，酵母抽提物0.12 g，調節反應pH，使其在一定的溫度和時間進行美拉德反應。

1.3.3 反應工藝的選擇

固定反應原料，控制時間60 min，溫度110 ℃，調節pH分別為4、5、6、7、8，優化美拉德反應的最佳pH值；固定反應原料，并將pH值調節最佳，將溫度調節為80、90、100、110、120 ℃，反應60 min，優化最佳反應溫度；固定反應原料，將pH和溫度調為最佳，調節反應時間為15、30、45、60和75 min，優化最佳反應時間。

1.3.4 褐變程度的測定

參考CHEN等[6]的方法并做適當修改，將雞骨架MRPs稀釋20倍，以水為參比，測定其在420 nm處的吸光值，吸光值表示褐變程度。

1.3.5 低分子香味中間體含量的測定

美拉德反應過程中會產生低分子香味中間體，一般用280 nm的吸光度值表示[7]，吸光度越大，產生的香味物質越多。將MRPs稀釋80倍，測定其在280 nm處的吸光度。

1.3.6 Friedman排序檢驗法

將MRPs稀釋10倍，置于常溫(27 ℃)下放置30 min，以避免因為溫度引起的評估差異。樣品以5個編號隨機編碼，呈現給10個經過培訓的感官評價員，評價過程中禁止評價員互相討論。感官評價方法參考Friedman排序檢驗法[8]，根據樣品的風味和可接受程度對樣品進行排序，用Kramer檢定法對樣品的顯著性差異進行分析。

1.3.7 Box-Behnken響應面試驗

響應面設計中因素及水平見表1。

表1 響應面設計因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface method

1.3.8 模糊感官評價

參考高娟等[9]的方法并做適當修改。

1.3.8.1 建立因素集和評語集

因素集是感官評價指標的集合。本試驗因素集U={u1，u2，u3，u4}={肉香味，烤香味，硫味，糊味}；評語集是感官評價員對因素集反饋信息的集合，本試驗以極優、優、良、中、差和極差為評語等級，評語集V={V1，V2，V3，V4，V5，V6}={極優，優，良，中，差，極差}，其中V1=5分、V2=4分、V3=3分、V4=2分、V5=1分、V6=0分。

1.3.8.2 建立感官評價因素權重集

通過用戶調查法確定雞骨架MRPs評價過程中肉香味、烤香味、硫味和糊味4個因素所占的權重。對4個因素在整體質量因素的權重進行打分，總分為10分，評價員認為肉香味、烤香味和硫味占的比重越大，評分越高，糊味占的比重越大，評分越低。根據10名評價員的評價結果進行處理后即可得到因素集的模糊權重向量α=(α1,α2,α3,α4)=(0.39, 0.34, 0.14, 0.13)，其中α1+α2+α3+α4=1。

1.3.8.3 模糊矩陣及模糊變換

統計各因素中每個等級票數占總票數的比例可得到Cij(i=1, 2, 3,…m；j=1, 2, 3, …n)，根據投票結果可以得出從α到V的關系矩陣Rk。其中，k為樣品編號，B為k號樣品的綜合評價結果，即Bk=α×Rk。最后各個評價的等級值乘等級分值后進行加和，得出模糊評價等級值Y，Y=B×V。

1.3.9 電子舌測定

參考石月等[10]的方法。準確移取30 mL樣品于燒杯中，按照1∶4體積比加入蒸餾水，以8 000×g離心10 min后通過0.45 μm濾膜抽濾至澄清，取40 mL樣品放于電子舌專用杯中進行檢測，采樣時間為120 s，每組樣品重復4次。運用系統自帶的數據庫進行分析。

1.3.10 電子鼻測定

參考GAO等[11]的方法并做適當修改，室溫下吸取1 mL樣品置于20 mL頂空瓶中，在室溫下放置20 min進行測定，每個樣品測3個平行。

1.3.11 氨基酸含量的測定

取10 μL樣品放置于離心管中，氮吹儀45 ℃下吹干，加入10 μL干燥劑，氮氣流吹干，加入衍生劑20 μL密閉衍生30 min，氮氣流下吹干，加入稀釋劑200 μL，上機測定。

1.3.12 揮發性風味物質的測定

參考胡洋健等[12]的方法。采用氣相-離子遷移譜(GC-ion mobility spectroscopy, GC-IMS)對酶解液和MRPs進行揮發性風味物質的檢測。分別取100 μL放入頂空進樣瓶，80 ℃孵化10 min，每個樣品運行時間30 min。

1.4 數據處理

數據用平均值±標準差表示(n=3)，用SPSS Statistics 25軟件進行單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，如果ANOVA效應顯著，用Duncan’s方法進行多重比較，顯著水平設為P<0.05；響應曲面試驗用Design-Expert 8.0.6軟件進行設計和結果統計分析，用Origin 2018軟件繪圖；利用R軟件結合FactoMineR[13]和factoextra[14]程序包對電子鼻測定結果進行主成分分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 pH對美拉德反應的影響

由圖1可知，隨著pH的增加，420 nm處的吸光值逐漸增大，表明褐變程度逐漸升高，280 nm處的吸光值在pH 4～8先升高后降低，在pH為6時有最大值0.66，反映出低分子香味中間體生成量先增加后減小。pH對美拉德反應的風味物質具有很重要的影響[15]，在pH過低時，肽段的氨基和氨基酸發生質子化，阻礙了羰胺縮合反應，使得一些特征風味減少[16]，pH較高時反應速度加快[17]，但是褐變嚴重且生成不具有香味的大分子物質，故pH為6時低分子香味中間體生成量最高。

圖1 不同pH對MRPs褐變程度和中間產物生成量的影響Fig.1 Effect of different pH on the browning degree of MRPs and the amount of intermediate products注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

根據Friedman排序檢驗法對不同pH的樣品品質進行評價，不同pH條件下的秩和見表2，秩次從大到小表示品質從優到劣，樣品進行顯著性分析，查表3得J=10(評價員數)，P=5(樣品數)的臨界值，上段用于確定樣品間是否有顯著性差異，若有顯著性差異，通過下段對樣品的顯著性差異進行分組。在5%顯著性水平上，由Rimin=20>17=RE，Rimax=40<43=RC可知，各樣品在該水平上有顯著性差異，通過下段將樣品分組：<23的為一組，>37的為一組，位于23～37的為一組，因此，將5個樣品分為3組：ABD、C和E組，由此可知，C組(pH 6)整體風味最好，E組(pH 8)整體風味最差。低pH造成的還原環境促進H2S的釋放從而形成多硫化物[18]，pH過高時，產生較多的NH3，在這2個條件下，均不能產生較好的風味。通過秩和比較RC=43>RB=37>RD=30，選擇pH 6為反應的最佳pH。

2.1.2 溫度對美拉德反應的影響

如圖2所示，隨著溫度的升高，褐變程度增加(P<0.05)，美拉德反應在第3階段產生的類黑精類物質增多，反應體系顏色加深。低分子香味中間體的生成量隨著溫度增加呈現先增加后降低的趨勢(P<0.05)，在100 ℃時280 nm處吸光值達到0.63，低分子香味中間體積累量最多，溫度較高時一些糖類物質遭到破壞，蛋白肽發生熱降解，產生過多雜味物質，同時伴隨有焦糊味[9]，這可能是溫度升高低分子香味中間體生成量減少的原因之一。TAN等[19]提出不同的溫度會導致反應沿不同的支路進行，故溫度不同時褐變程度和低分子香味中間體生成量有較大的區別。

由表4可知，在5%顯著性水平上，由Rimin=21>13=RE，Rimax=40<45=RC可知，各樣品在該水平上有顯著性差異，通過下段將樣品分為3組，AE、BD和C組，由此可知，C組(100 ℃)整體風味最好，肉香濃郁，B組(90 ℃)和D組(110 ℃)次之，A組(80 ℃)和E組(120 ℃)整體風味最差。溫度較低時蛋白質與糖反應不充分，游離氨基不會馬上暴露出來，肉香味沒有被完全釋放出來，溫度較高時有較大的焦糊味等不愉快的氣味。故選擇100 ℃作為反應溫度。

2.1.3 時間對美拉德反應的影響

如圖3所示，隨著反應時間的延長，MRPs褐變程度顯著增大(P<0.05)，類黑精物質的生成量也不斷增加。在15～60 min，低分子香味中間體生成量不斷增加(P<0.05)，而后隨著時間延長而減小，在60 min時有最高的低分子香味中間體生成量。

表4 不同溫度下樣品的秩和Table 4 Rank sum of samples at different temperatures

圖3 不同時間對MRPs褐變程度和中間產物生成量的影響Fig.3 Effect of different time on the browning degree of MRPs and the production of intermediates

由表5可知，在5%顯著性水平上，由Rimin=21>20=RE，Rimax=40<42=RD可知，各樣品在該水平上有顯著性差異，通過下段將樣品分為3組，ABC、D和E組，由此可知，D組(60 min)整體風味最好，ABC組次之，E組整體風味最差，原因可能是時間太短，美拉德反應不充分，產生的風味物質較少，時間太長，會產生較重糊味和硫味，掩蓋肉香味和烤香味。選擇60 min作為后續反應時間。

表5 不同反應時間樣品的秩和Table 5 Rank sum of samples at different time

2.2 響應面試驗結果及最佳工藝驗證

2.2.1 回歸模型的建立和方差分析

響應面實驗設計及結果如表6所示，對實驗結果進行方差分析，對數據進行多元回歸擬合，得到感官評價對pH(A)、溫度(B)、時間(C)的二次響應曲面回歸方程如下：

Y=86.19-4.05A-6.94B-1.82C+0.085AB-1.91AC-0.84BC-7.63A2-8.39B2-7.63C2

表6 響應曲面試驗設計與結果Table 6 Design and experimental results of response surface methodology(RSM)

表7 感官評價結果方差分析Table 7 Analysis of variance of sensory evaluation results

圖4能比較直觀地表示出當固定1個因素為中心點水平時，其他各因素交互作用對感官評價的影響，當固定1個因素，隨著另一因素水平的升高，響應值均是先增大后減小，在中間出現最大值，與單因素試驗結果一致。

圖4 感官評價模型中各因素交互響應面圖Fig.4 The interactive response surface of various factors in the sensory evaluation model

2.2.2 工藝優化與結果驗證

結合響應曲面進行優化分析，以感官評分為評價指標，得到美拉德反應的最優工藝為pH 5.71，59.12 min，107.03 ℃，在此條件下感官評分的預測值為82.49。為方便操作，將其修正為pH 5.7，60 min，105 ℃，得出感官評分為82.66，與預測值接近，表明預測值與實際值擬合較好，模型可行。

2.3 美拉德反應對酶解液滋味輪廓的影響

電子舌可以反映不同樣品的滋味特性差異，一般認為酸味值>-13，咸味值>-6，甜味、鮮味和澀味>0時，認為有該味道[20]。由圖5可知美拉德反應前后有一定的滋味差異。其中酸味、咸味和豐富度顯著增加(P<0.05)，苦味、鮮味、甜味降低(P<0.05)，這可能是由于美拉德反應產生了大量的呈味物質。鮮味降低可能是因為在反應過程中pH值逐漸降低呈現酸性，導致谷氨酸無法生成谷氨酸鹽[21]。反應后酸味響應值增加，酸味對苦味有一定的掩蓋作用[10]，苦味響應值降低，表明美拉德反應對苦味有一定的削弱作用，能在一定程度改善酶解液的風味，這可能與氨基酸中精氨酸(Arg)和組氨酸(His)含量減少有關，陳曉[22]對雞肝蛋白酶解物進行美拉德反應后也得到了相似的結果。由以上結果可知，美拉德反應可以改善酶解液的苦味，增加咸味，豐富產物的風味。這與高娟等[9]對羊肚菌美拉德反應前后的滋味分析結果一致。

圖5 酶解液和美拉德反應產物電子舌響應值的雷達圖Fig.5 Radar diagram of electronic tongue response values of enzymatic hydrolysate and Maillard reaction liquid注：MJY、MRPs分別表示酶解液和美拉德反應產物(下同)

2.4 美拉德反應對酶解液氣味輪廓的影響

電子鼻作為一種新型智能感官技術，可以對不同樣品的香氣進行分析，能減少人感官評價所帶來的誤差，重復性好[23]。其有10個不同的傳感器，由每個傳感器的響應值繪制雷達圖和主成分分析(principal component analysis，PCA)圖(圖6)。主成分1和主成分2的貢獻率分別為63.3%和25%，貢獻率之和達到88.3%，能解釋大部分處理給酶解液和MRPs帶來的變化，表明該評估方法有一定的可行性。經過美拉德反應后，極大地增加了W2W和W1W兩個傳感器的響應值，這2個傳感器分別對有機硫化物和硫化物靈敏。有研究[24-25]對肉中的風味物質進行檢測，發現含硫化合物是肉香的主要化合物，對肉制品的風味起關鍵作用。其呈味閾值低，朱照華[26]提出含硫化合物主要通過美拉德反應產生，本試驗中反應后的有機硫化物和硫化物都比反應前增加了100%，顯著增加了肉香味。W3S、W5C、W6S傳感器分別對長鏈烷烴、短鏈烷烴芳香成分、氫化物有選擇性，反應前后這幾個傳感器的響應值變化不大。W2S、W1S、W5S傳感器分別對醇和醛酮類、甲基類和氮氧化合物敏感，經過美拉德反應這幾個傳感器的響應值略有升高。W3C(對芳香成分敏感，氨類)、W1C(對芳香成分敏感，苯類)2個傳感器的響應值略有降低。總體來說，美拉德反應可以產生更多的含硫化合物，同時使氨類等不愉快的氣味減弱，整體風味得到改善。

a-雷達圖；b-PCA圖圖6 酶解液和美拉德反應產物電子鼻響應值的 雷達圖和PCA圖Fig.6 Radar and PCA of electronic nose response values of enzymatic hydrolysate and Maillard reaction liquid

2.5 美拉德反應對酶解液游離氨基酸含量的影響

酶解液和美拉德反應前的氨基酸含量如表8所示，大多數氨基酸在美拉德反應后含量減少，其中酪氨酸、賴氨酸和異亮氨酸減少比例最高，分別達到71.81%、56.66%和55.79%，表明這3種氨基酸是參與美拉德反應的主要氨基酸，童彥等[17]分析了魚蛋白水解液美拉德反應前后的氨基酸組成變化，發現酪氨酸、賴氨酸和精氨酸是反應的主要氨基酸，與本研究結果相近。反應后甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸含量大幅增加，其中甘氨酸和絲氨酸為甜味氨基酸，可提供清香甜味，減弱苦味，從食物中去除不愉快的氣味[27]；半胱氨酸屬于含硫氨基酸，對肉香味的形成有重要作用。

表8 美拉德反應前后氨基酸含量Table 8 Amino acid content before and after Maillard reaction

2.6 美拉德反應對揮發性風味物質的影響

本研究中酶解液和MRPs共檢測出80余種揮發性風味物質，根據NIST質譜庫，共鑒別出29種物質，其中包括8種醇類物質、6種醛類物質、7種酮類物質、3種烯類物質、3種酯類物質和2種吡嗪類物質，多數物質同時具有單體和二聚體。酶解液和MRPs揮發性風味物質的指紋圖譜見圖7，顏色越深代表含量越高。

圖7 酶解液和MRPs的指紋圖譜Fig.7 Fingerprint of enzymolysis solution and Maillard reaction solution

表9列舉出了反應前后相對含量較高或存在較大差異的物質及其相對含量。在已鑒別出類別的物質中，醇類、醛類和酮類對水解液和MRPs貢獻較大，且水解液中這3類物質的含量顯著高于MRPs(P<0.05)，水解液中醛類物質含量最高，達到22.73%，MRPs中醇類物質含量最高，達到15.15%，其中反應后1-己醇和乙醇的含量顯著高于反應前，1-己醇具有的水果芬芳香氣和乙醇具有的酒香味，這種物質改善了酶解液的風味。與醇類、醛類和酮類相比，一些揮發性化合物(例如烯類、酯類和吡嗪類)對整體香氣貢獻程度較少，水解液中烯類物質含量顯著高于MRPs(P<0.05)，經過美拉德反應后酯類和吡嗪類物質含量顯著增加(P<0.05)，吡嗪類屬于雜環化合物，具有氣味閾值低的特點，對整體風味的改善也具有重要的作用[6]。除此之外，由于NIST數據庫的有限性，還含有29種未被定性的物質，它們的含量有較大差別，也是反應后風味改變的原因。

表9 揮發性風味物質相對含量Table 9 Relative contents of volatile flavor substances

續表9

3 結論

本研究通過單因素試驗和響應曲面優化試驗得到美拉德反應的最優條件為pH 5.7，時間60 min，溫度105 ℃。在此條件下制備的MRPs與反應前相比，削弱了酶解液的苦味，增加了咸味，豐富了整體風味，游離氨基酸總量大幅增加，其中酪氨酸、賴氨酸和異亮氨酸含量減少最多，說明這幾種氨基酸是參與美拉德反應的主要氨基酸。由GC-IMS分析可知，經過美拉德反應，醇類、醛類、酮類和烯類物質含量減少，而酯類、吡嗪類和一些未被定性出來的物質含量增加。本研究為制備出肉味逼真的風味基料提供理論參考。