畢赤酵母高效表達外源蛋白的分子水平策略

張欣然，凌焱，楊英*

1(軍事醫學研究院 輻射醫學研究所，北京，100850)2(河北大學 生命科學學院，河北 保定，071000)

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)作為被應用最廣泛的工程菌之一，已有超過5 000種外源蛋白利用其表達并進行工業化制備。其中不僅包括脂肪酶、植酸酶、甘露聚糖酶等應用范圍廣泛的工業酶，還包括人血清白蛋白、胰島素、乙肝表面抗原等具有重要應用價值的藥物相關蛋白。畢赤酵母在重組蛋白表達方面的成功是由于其易于實現工業化大批量發酵生產，且自分泌的蛋白較少，相較于原核表達系統，畢赤酵母還具有翻譯后修飾等功能。但是畢赤酵母表達系統仍存在著表達效率低、外源基因不穩定、蛋白在細胞內易被降解等問題。為解決上述問題，學者從外源基因的特性、菌種、表達環境和發酵技術等多個方面對畢赤酵母表達系統進行改造，以期望達到更高效的外源蛋白表達效果。本文著眼于分子水平上的基因轉錄、蛋白質加工、蛋白質降解模塊以及轉運分泌4個模塊，對利用畢赤酵母表達系統通過優化為畢赤酵母偏嗜型密碼子、插入多拷貝數的外源基因、選擇合適的啟動子以及高效率的引導肽、敲除相關蛋白酶的基因、共表達促折疊因子等方式使外源蛋白高效率表達的相關分子水平策略進行了簡要綜述。

1 畢赤酵母表達系統簡介

酵母菌是一種當前被廣泛應用于生產蛋白質類藥物的菌種。在酵母菌細胞中，蛋白質的表達機制與哺乳動物細胞中的相似。與細菌相比，酵母細胞具有生長速度快、翻譯后修飾、分泌表達、易于遺傳操作等優點。目前已經有超過5 000種異源蛋白可以利用畢赤酵母成功表達[1]。不同于其他表達系統，選擇畢赤酵母作為表達外源蛋白菌株的優勢主要有以下幾點：

(1)高表達。區別于釀酒酵母的GAL1啟動子，畢赤酵母具有的AOX1啟動子是強誘導型啟動子，其蛋白表達水平是釀酒酵母的10～100倍，甲醇可作為其唯一碳源，實現高效的異源表達，大量外源蛋白表達量達到g/L水平，如人血清白蛋白表達量能達到10 g/L[2]，木葡聚糖內轉糖苷酶表達量能達到5 g/L[3]。

(2)高分泌。由α-因子信號肽引導，將外源蛋白分泌至胞外。外源蛋白的含量占培養基中總蛋白量的80%～90%，并且畢赤酵母較少分泌內源性蛋白，這就對后期目的蛋白的分離純化提供了極大的便利。

(3)高穩定性。在釀酒酵母中，質粒復制進行游離表達；然而，在畢赤酵母中，質粒整合在宿主染色體上，因此重組菌株非常穩定，即使沒有外界抗生素的篩選壓力，外源基因仍能穩定存在于宿主染色體基因組[4]。

(4)糖基化程度低。雖然釀酒酵母和畢赤酵母的N-連接糖基化都是甘露糖形式，但畢赤酵母翻譯后將長度為8～14個甘露糖殘基的寡糖鏈添加到蛋白上去，相比于釀酒酵母翻譯后添加到蛋白上的50～150個甘露糖殘基要短很多。除此之外，畢赤酵母的O-連接糖基化也非常少[5]。

(5)培養成本低。畢赤酵母對培養基的營養要求低，可使用成本低廉的培養基進行大規模發酵，又因為其好氧生長速度快，適合高密度培養，十分有利于工業化放大生產[6]。

2 影響外源蛋白表達的因素

畢赤酵母不僅具有許多原核生物容易培養等優點[7]，同時克服了許多釀酒酵母系統存在的缺陷[8]，十分適合高水平外源基因的表達，目前被廣泛用于生產各種工業酶[9]和藥用蛋白[10]。然而，使用畢赤酵母進行工業化生產仍存在許多限制，如需要易燃化學物質甲醇來誘導表達、延長發酵時間和低表達水平。因此，可根據限制畢赤酵母高效表達的因素，通過合理設計實驗條件[11]、開發強啟動子、優化蛋白質分泌途徑[12]、改變蛋白質糖基化[13]和轉錄因子的共表達[14]等方式來增強外源蛋白在畢赤酵母中的表達效率。表1總結了影響畢赤酵母表達外源蛋白效率的因素以及對應的提高表達效率的方法。

表1 影響畢赤酵母表達外源蛋白效率的因素Table 1 Factors affecting the expression efficiency of exogenous proteins in Pichia pastoris

3 高效表達的分子水平策略

3.1 基因轉錄模塊

基因轉錄模塊主要分為密碼子的優化、基因劑量的優化、啟動子的選擇與優化3個部分。密碼子的優化主要采用的方法是將外源基因的密碼子設計成畢赤酵母偏好的密碼子；基因劑量的優化主要是增加外源基因拷貝數，通過體外構建法或者體內構建法來達到高效表達外源蛋白的目的；而啟動子優化是通過人為選擇，利用轉錄強度高且制約因素少的啟動子來表達外源蛋白，從而提高表達效率。

3.1.1 密碼子優化

外源基因的密碼子和其mRNA的二級結構影響了外源蛋白表達效率的高低。畢赤酵母有其偏好的一套表達密碼子，構建表達載體時需將外源基因按照其偏好的密碼子進行優化，如果外源基因的密碼子與畢赤酵母偏好的密碼子不一致，將會在mRNA翻譯時導致順序錯位無法正常譯出，甚至提前終止。除此之外，mRNA的5′非翻譯區(5′ untranslated region，5′UTR)序列對外源基因的表達水平起關鍵調控作用，使用AOX1基因的5′UTR可顯著提高外源基因的表達量。

密碼子優化是在確保外源蛋白質的氨基酸序列不發生變化的基礎上，改造為畢赤酵母偏好的外源基因密碼子類型。李富強等[32]通過密碼子優化將豬圓環病毒2型Cap蛋白的表達量由近乎為0提高到155 mg/mL。顧莉莉等[33]通過密碼子合理優化將黑曲霉的Ⅱ型脂肪酶表達量提高了174.5 U/L。通過優化外源基因的密碼子也可以實現多種外源蛋白的共表達。唐小雁等[34]通過密碼子優化UDP-糖基轉移酶UGT76G1和蔗糖合成酶AtSUS基因，實現了雙酶在畢赤酵母中的胞內共表達。因此，通過優化密碼子可以提高畢赤酵母中外源蛋白質的合成速率。

3.1.2 基因劑量的優化

提高外源基因劑量的主要方法是增加基因拷貝數。一般情況下，單拷貝的基因在畢赤酵母中的表達量普遍較低，可以通過體內構建或者體外構建來適當增加基因拷貝數使效率提高。

體內構建法是在體外逐步地串聯外源基因的表達盒，以此得到多拷貝數的表達質粒。主要依賴于限制性內切同尾酶的作用，但由于載體分子質量本身較大，隨著拷貝數增加其操作也變得越來越困難，一般情況下最多只能構建到6拷貝左右。王義春等[35]通過密碼子優化、體外多拷貝構建的方法，將外源基因與α-因子信號肽編碼序列一起合成，通過酶切酶連構建含1～6個表達盒的表達質粒，獲得玉米赤霉烯酮降解酶的重組菌株，其重組蛋白表達的分子質量為28.9 kDa。劉潔等[36]優化β-胡蘿卜素合成限速酶的基因拷貝數，構建了β-胡蘿卜素產量為3.7 mg/g菌體干重的新菌株Pp-EYBI+(YB) 3H。呂星星等[37]使用同尾酶法構建了鱖魚β-防御素(Sinipercachuatsiβ-defensin, ScBD)基因的2拷貝和4拷貝表達盒載體pPICZαA-ScBDn(n=2或4),分別電轉至畢赤酵母X-33后成功篩選到各種重組菌株。結果表明，含1拷貝、2拷貝和4拷貝表達盒載體的重組菌株的基因組中ScBD基因的拷貝數分別為1.19×105、2.56×105和5.29×105，證明載體所含的表達盒數目與嵌合進畢赤酵母基因組中的ScBD基因拷貝數之間存在正相關關系，也由此證明了多拷貝表達盒載體的構建是提高目的基因拷貝數和轉錄水平的有效方法。增加基因的數量可以在一定范圍內增加外源蛋白質的合成，但是過多的拷貝會增加宿主的代謝負荷。WU等[38]表達內質網氧化蛋白時的拷貝數超過5時，表達水平顯著降低。

體外構建法通常是通過抗生素壓力篩選得到多拷貝外源基因菌株，如提高G418抗性的濃度，能篩選到基因拷貝數為7～12的表達菌株。SCORER等[39]在含有不同濃度的G418平板上涂布畢赤酵母轉化子，通過測出每塊板上轉化子的外源蛋白的表達水平，提出了外源基因的拷貝數和G418篩選濃度存在正相關性的觀點。目前一種新的篩選方法則是利用熒光蛋白作為分子信標，直觀快速地做高表達菌株的篩選，虞維紅[40]通過2A肽將綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別與抗菌肽PR39多拷貝進行融合表達，篩選得到的D-PR39-Y菌株表達量提高了69.4%。陳永安等[19]通過檢測菌株的熒光值代替檢測重組蛋白的表達水平和活性，根據綠色熒光值的高低對包含不同植酸酶表達水平的重組菌株的菌群進行分選，從而實現多拷貝菌株的篩選，大大提高了其應用的便捷性及通用性。

3.1.3 啟動子的選擇和優化

啟動子是基因表達的關鍵元件。啟動子的強度與外源基因的mRNA水平及外源蛋白的表達量直接相關，選擇適用的啟動子有利于外源蛋白的高效合成。啟動子可分為需要誘導劑的誘導型啟動子和不需要誘導劑的組成型啟動子。AOX1基因的啟動子——PAOX1是常用的誘導型啟動子，該啟動子受甲醇的誘導，被葡萄糖和甘油抑制，因此可通過更換不同的碳源(甘油或甲醇)，使細胞生長與外源蛋白合成2個過程分開，有利于平衡生物量與積累外源蛋白。在畢赤酵母PAOX1控制下，外源蛋白在細胞內的表達量能達到20 g/L，其分泌表達量可達到15 g/L。MOMBENI等[41]用甲醇氧化酶基因(pMOX)的啟動子區域在蛋白酶缺陷型和野生型畢赤酵母菌株中探索異源表達外源蛋白情況。MOX的啟動子區被分離出來，并用pPINK-HC質粒中的pAOX1取代。引入了pMOX這種新的小而強的無甲醇啟動子，用于在畢赤酵母中生產重組蛋白。

目前不同來源的多種誘導型啟動子被發現并被利用，如磷酸轉運載體基因的啟動子PPHO89(磷酸缺少時被誘導)、異檸檬酸裂合酶基因的啟動子PICL1(乙醇誘導)等。甘油醛三磷酸脫氫酶基因的啟動子PGAP是最常用的組成型啟動子，其在葡萄糖和甲醇條件下具有相同的轉錄強度。PGCW14是畢赤酵母中發現具有最高轉錄強度的組成型啟動子，當葡萄糖是唯一碳源時，將EGFP用作報告蛋白，其表達量比PGAP控制下的表達量提高了10倍，當甘油為唯一碳源時，表達量提高了5倍。

3.2 蛋白加工模塊

內質網是真核生物中蛋白分泌表達加工折疊的主要場所，即使可從多種高效的引導肽中選擇最合適的引導肽，其新合成蛋白的通量增加會導致內質網中未折疊和錯誤折疊的蛋白積累，使外源蛋白在畢赤酵母細胞中滯留，當表達水平高時，尤其如此。當在細胞中合成大量的外源蛋白質并且沒有被及時折疊時，會給內質網造成壓力，當未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網中大量積累，遠超過分子伴侶輔助折疊的能力，超出降解系統清除錯誤蛋白的限度時，往往會造成內質網的損傷，稱為內質網脅迫，也叫內質網應激。嚴重時還會引起其他細胞器的損傷、細胞自噬，甚至造成細胞死亡。

為了解決這個問題，可以通過導入促折疊因子基因使得菌株過表達促折疊因子，及時促進折疊和分泌大量的外源蛋白質，這些促折疊因子對提高蛋白質產量有顯著作用。王晨蕾等[42]在重組菌株中分別過量表達蛋白質折疊(BIP、ERO1)、囊泡運輸(SEC53、SEC1)、脅迫應激(Hac1、GCN4)相關的6種分子伴侶，結果顯示，共表達這6種分子伴侶對分泌表達漆酶的菌株PP-L的正常生長沒有影響；共表達BIP使重組菌胞外酶活力提高359%，共表達ERO1胞外酶活力反而降低22%；共表達其他4種分子伴侶胞外酶活力提高18%～53%。組合共表達BIP和Hac1的重組菌較之前胞外酶活力提高了602%，酶活力達到3 896 U/L。但是，此類折疊因子的表達也將占據一定量的細胞資源，需要進一步的實驗來確定實際的促進折疊的作用和最佳的促進分泌的劑量。

此外，真核細胞已經進化出未折疊的蛋白質反應(unfolded protein response, UPR)途徑來應對內質網壓力并維持蛋白質折疊的穩態。UPR信號傳導是一個進化上保守的通路，尤其是在酵母和絲狀真菌中表現出相當的保守性，由內質網腔的未折疊蛋白累積造成脅迫來自然激活。如圖1所示通路上的轉錄因子Hac1p在激活、維持這一信號途徑中起著關鍵作用，通過依賴于UPR信號響應元件(unfolded protein reaction element，UPRE)調節蛋白折疊或降解等相關基因的轉錄過程，來緩解產生于內質網腔的這種脅迫。內質網未折疊蛋白的增加會減少分子伴侶Kar2，導致形成具有激酶和核酸酶活性的Ire1成形二聚體，該二聚體與未折疊蛋白結合。磷酸化后，它可以激活并影響其核酸酶活性，對轉錄因子Hac1的mRNA進行特異性的非經典剪切，使Hac1去除內含子來正常表達(通過將Hac1轉換為Hac1i)。然后，轉錄因子Hac1進入細胞核，與UPR靶基因啟動子的響應元件結合，并啟動UPR靶基因的轉錄，從而使細胞能夠抵消內質網壓力。內質網壓力響應因子的共表達或用于內質網蛋白加工的分子伴侶和相關酶的過表達都有助于提高內質網蛋白加工的水平，因此能夠進一步提高產量。閔琪等[43]利用畢赤酵母表達甘露糖聚酶ManA(Accession No.KJ806637)時，將Hac1與ERO1、PDI、PDI1、CPR5、BiP這5種與蛋白折疊相關的分子伴侶共表達，使酶活力提高了26%，最高達到1 014 U/mL。

圖1 酵母UPR的激活Fig.1 Activation of UPR in yeast

目前的研究熱點多集中在提高外源基因拷貝數以及共表達分子伴侶，這2種方案都需要向酵母基因組中整合新的質粒片段，而這樣的基因操作是有次數限制的：宿主能接受多少種篩選壓力，類似的片段整合就能進行多少次。之前的研究中，有學者嘗試針對一種抗生素通過不斷提高其濃度反復進行電擊轉化，進而篩選多拷貝宿主，但這種方法極易產生假陽性，且篩選轉化子的工作量非常大。對于畢赤酵母而言，能夠被實際運用于基因工程的標記基因數量有限，進行多次基因操作時會受到限制，所以篩選經多次基因修飾的重組菌株時就會相對困難。同時，利用多個標記基因篩選重組菌株也會增加前期載體構建的復雜程度，因此可以通過有效地消除標記基因克服這些難題。利用無標記基因操作的方法可實現基因的敲入、敲除、定點突變等基因操作，篩選標記回收后還可以重復利用，從而對同一個宿主菌株進行多次基因修飾且不會引入多余的標記基因。牛碩等[44]利用kFPR1基因作為反向篩選標記，建立了一種適用于畢赤酵母的無標記基因操作方法，實現篩選標記在基因操作過程中的回收以及靶基因的成功整合，克服了篩選標記選擇的限制，以實現外源基因在畢赤酵母中的高效合成。

3.3 蛋白降解模塊

在表達外源蛋白期間，畢赤酵母的胞內或胞外都存在著蛋白酶。因此，大多數的外源蛋白都存在著被蛋白酶降解的風險。一旦被蛋白酶水解，不僅會使外源蛋白表達量大大降低，同時也會使其后續純化變得十分困難。胞內蛋白酶主要降解蛋白質前體以產生具有活性的蛋白質，或者從膜上運輸后切割蛋白質的信號肽，使調節蛋白、變異體或不需要的蛋白質失活，參與分解蛋白質，提供營養、前體和能量。胞外蛋白酶分泌的較少，主要分解某些蛋白質以提供營養，例如氨基酸和肽。

改造蛋白降解相關途徑可大大減緩目的蛋白被降解的概率，從而提高產量。目前，最常用的避免蛋白酶降解的方式就是敲除相關蛋白酶的基因。近年來基因編輯技術作為代謝工程的一個重要工具受到廣泛關注，除了傳統的同源重組外，許多新型基因編輯技術也應運而生，比較熱門的技術包括鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)技術、類轉錄激活因子效應物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術和CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas endonuclease)系統，其中CRISPR/Cas9系統是目前比較熱門且使用較多的技術，其作用機制如圖2所示。可利用CRISPR/Cas9編輯技術，通過外源DNA修復DNA雙鏈斷裂形式，讓外源基因在某一個點發生突變，或利用gRNA串聯形式可以同時對多個靶位點定點修飾。同時設計外源片段，可以定位插入到靶位點，實現畢赤酵母本身特定基因的插入、敲除、替換。谷洋[45]構建了RNA pol Ⅲ啟動子控制下的CRISPR/Cas9系統用于高效表達人血清白蛋白，這一新系統的編輯效率高達80%。蔣秋琪等[46]使用CRISPR/Cas9技術分別敲除谷胱甘肽降解途徑中的3個基因DUG1(YFR044c)，DUG2(YBR281c)和DUG3(YNL191w)。其中，敲除DUG3基因的畢赤酵母，谷胱甘肽產量從160 mg/g提高到了224 mg/g。

圖2 CRISPR/Cas9的作用機制Fig.2 Mechanism of action of CRISPR/Cas9

避免被蛋白酶降解還可以向甲醇補料溶液中添加特異性蛋白酶抑制劑。SHI等[47]使用巴斯德畢赤酵母表達一種抗馬氏桿菌絲氨酸蛋白酶抑制劑單鏈抗體時，發現添加絲氨酸蛋白酶抑制劑使發酵液的總蛋白酶活性降低了53%，而天冬氨酸蛋白酶抑制劑降低了總蛋白酶活性30%。

除了敲除蛋白酶基因和添加蛋白酶抑制劑以外，還可以將目的蛋白與蛋白酶抑制劑或者畢赤酵母中的穩定的蛋白伴侶共表達。此外，將目的蛋白運輸至過氧化物酶體也可避免其被降解，只需在目的蛋白上連接一個過氧化物酶體靶向信號，這種方法同時減少了外源蛋白對宿主細胞可能具備的毒性副作用。

3.4 轉運分泌模塊

在畢赤酵母中重組蛋白分泌到胞外必須經過信號肽的引導。由于信號肽與目的蛋白融合表達，從而使目的蛋白在加工折疊后被引導分泌到胞外。常用的酵母信號肽有α交配因子信號肽(MF-α)、酸性磷酸脂酶信號肽(PHO1)、蔗糖酶信號肽(SUCZ)、Killer毒素信號肽和菊粉酶信號肽(INU)等。MF-α是畢赤酵母表達重組蛋白時應用最廣泛的一種信號肽，最常用的分泌型表達載體pPIC9K和pPICZα-A的信號肽就是MF-α。MF-α對引導小分子多肽和蛋白的分泌非常有效，但對于引導大分子蛋白的分泌效果并不明顯。研究表明，分泌信號肽是影響外源蛋白在畢赤酵母中表達的重要因素。苗楊利等[48]通過Signal P4.1在線預測軟件預測出9種具有分泌潛力的畢赤酵母內源信號肽序列：FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9。以MF-α信號肽為對照，考察這9種內源信號肽對EGFP和米黑根毛霉脂肪酶(RhizomucormieheiLipase，RML)在蛋白酶缺陷型Pichia PinkTM表達系統的分泌效果。結果發現FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介導EGFP分泌，且PRY2、DSE4、MSB2、FRE2介導EGFP的分泌水平優于MF-α，分別是MF-α的2.15倍、1.15倍、1.33倍、1.3倍；FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介導RML的分泌，且FLO10介導RML的分泌水平最高，是MF-α的1.5倍，證明了內源信號肽FLO10更能有效分泌RML。

N端信號肽的序列會影響蛋白易位進入內質網的效率，通過修飾N-末端或通過去除額外的接頭肽可以提高外源蛋白分泌的效率。隨著內質網蛋白的加工和折疊通量的增加，從內質網到高爾基體和細胞膜的下游運輸通量已成為外源蛋白分泌和表達的瓶頸。可通過轉運相關因子的過表達來改善下游分泌通量并增加外源蛋白的表達。畢赤酵母中分泌小泡蛋白Sec4的過度表達使米根霉來源的葡糖淀粉酶的分泌和表達增加了一倍。調節分泌和碳源反應相關基因的轉錄因子Aft1的過表達也可以顯著增加外源蛋白的表達量。王儒昕等[49]采用共表達分子伴侶二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)或轉錄因子Aft1的方法來提高重組人溶菌酶(human lysozyme，HLY)的表達量，共表達PDI的HLY表達量增加了8.3%，共表達Aft1的HLY的胞外總蛋白增加了46.5%。

4 展望

畢赤酵母作為一種重組蛋白表達系統，其比傳統的原核表達系統具有許多顯著優勢，備受歡迎，針對畢赤酵母高效表達外源蛋白的優化改造等研究工作也陸續展開。研究人員已從外源基因表達盒、分泌途徑、出發菌株、基因編輯與發酵過程控制等方面建立多種方法來提高表達效率。特別是在分子水平上，使用有效的分子操作方法和工具對畢赤酵母表達菌株和外源基因進行修飾，這樣可以使外源基因更加適應宿主菌的表達偏好。從分子水平上改造外源基因的方法不僅節省了時間和成本，而且顯著提高了目的蛋白在畢赤酵母中的表達效率，使蛋白表達量大幅增加。此外，還可通過啤酒酵母等相近酵母菌株合成天然大分子產物(如青蒿素、大麻二酚等)的實例得到啟發，對于較難合成的外源蛋白如何在分子水平上對其基因或者宿主菌進行改造有了新思路。另一方面，基因組測序技術的發展，能夠為非常規酵母提供完善的基因組注釋信息。轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學等技術從宏觀角度反映工程菌代謝網絡信息，揭示工程菌體內調控模式，為代謝工程改造提供靶點。由于對畢赤酵母生理生化特性認識有限，在目前模式生物構建一碳同化效率低的背景下，從組學角度出發，可能能夠更好地探索和闡釋一碳同化機制，提高甲醇同化效率，為構建高效畢赤酵母細胞工廠提供指導。

分子生物學不斷發展，各種相關技術也在不斷推陳出新，研究人員將通過更多的途徑以及更有效的分子操作方法和工具來改造畢赤酵母表達菌株，獲得表達效果更好的生產菌株，相信未來會有更多稀有蛋白通過畢赤酵母被大量地生產出來。