自噬調控在大鼠缺血性腦卒中亞急性期神經修復中的機制研究

周 平 徐偉杰 臧 瑞 李友寬 武煜明

1.昆明衛生職業學院解剖教研室，云南昆明 650600；2.云南省昭通市中醫醫院急診科，云南昭通 657000

腦卒中是一種高發病率及致殘率的急性腦血管疾病，其中約80%為缺血性腦卒中[1-2]，腦組織局部血流供應完全中斷會導致細胞迅速死亡，使患者出現認知和運動功能障礙[3]。組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）是目前治療缺血性腦卒中的有效方法，但tPA 具有嚴格的適應證和狹窄的窗口期，僅有5%的患者可以進行tPA 治療[4]。腦卒中核心區周圍的腦缺血半影區內細胞凋亡和自噬并存，自噬將受損細胞器傳遞至溶酶體進行降解并產生能量[5-6]。本研究選擇大鼠左側大腦中動脈閉塞再灌注模型模擬缺血性腦卒中亞急性期，通過自噬誘導劑及抑制劑干預自噬活性探究神經元自噬的相關機制[7]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取8 周齡250～280 g 的SPF 級雄性健康SD 大鼠96 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號為：SCXK（湘）2019-0004；合格證號：No.430727210101005026。飼養于昆明衛生職業學院（以下簡稱“我校”）實驗動物中心，并通過我校動物倫理委員會審批（R-062021LH-122）。

1.2 主要藥物與試劑

TTC 試劑（G3005）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0010）、RIPA 裂解液（P0013B）、電致化學發光試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；微管相關蛋白輕鏈3（light chain 3，LC3）（83506）、Becline-1（3738）、β-actin（3700S）、神經元核心抗原（neuronal nuclei，NeuN）一抗（ab104224）、山羊抗兔二抗（SA00001-2）、DAPI（4038）購自Cell Signaling Technology 公司；水合氯醛（A600288）、Triton X-100（T8200）購自北京索萊寶科技有限公司，配制SDS 溶液、電泳液、轉膜液。Alexa Fluor-488-綴合抗小鼠IgG（ab150077）、Alexa Fluor-594-綴合抗兔IgG（ab150080）購自美國abcam 公司。

1.3 動物分組及造模

采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、雷帕霉素組、3-甲基腺嘌呤組，每組24 只。制備大鼠左側腦中動脈閉塞再灌注模型[8]，暴露大鼠左側頸內、頸外及頸總動脈，經頸外動脈切口插入4-0 尼龍線栓，經頸內動脈進入顱底到達大腦中動脈處（長度1.8～2.0 cm）頸外動脈遠端結扎固定并計時，激光多普勒血流儀檢測腦動脈血流中斷情況，90 min 后再灌注，以造模后Zea-longa 評分1～3 分為造模成功[9]。假手術組除不插入線栓外，其余各步驟均相同。

1.4 干預方法

10%水合氯醛麻醉后將大鼠俯臥固定于腦立體定位儀，于前囟后1.0 mm、中線左側1.5 mm、深3.8 mm的左側腦室留置給藥管，有腦脊液流出提示定位準確。雷帕霉素組給予雷帕霉素（8 ng 溶解于5 μl 0.1%DMAO 中），3-甲基腺嘌呤組給予3-甲基腺嘌呤（100 μg溶解于5 μl 0.1%DMAO 中），假手術組、模型組給予5 μl 0.1%DMAO 溶液，四組給藥均經側腦室泵入[10]。四組注射后留針5 min，1 次/d，連續7 d。

1.5 行為學評估

每組隨機選取6 只，根據改良大鼠神經功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）[11]分別從反射缺失或異常運動（0～4 分）、運動測試（0～6 分）、感覺實驗（0～2 分）、平衡木實驗（0～6 分）進行評分，得分越高表示大鼠神經功能缺損越嚴重。

1.6 腦梗死體積檢測

行為學評估后，每組另取6 只完整大腦于-20°C冰箱中冷凍20 min 后沿冠狀面切成2 mm 厚的腦片，37°C 下TTC 染色30 min，4%多聚甲醛固定12 h 后拍照，未染色的白色區域為梗死區域。腦梗死體積占比（%）=腦梗死體積/同側半球體積×100%。

1.7 免疫熒光染色

每組另取6 只大鼠麻醉，取完整大腦于20%蔗糖溶液中脫水24 h。采用冷凍切片機將其切成20 μm厚的冠狀切片放于原位雜交保護液中。PBS 洗滌腦片后采用0.2%Triton X-100 透化15 min，10%BSA 封閉45 min 后將腦片分別與LC3（1∶400）和NeuN（1∶400）4℃過夜，與Alexa Fluor-488-綴合抗小鼠IgG（1∶800）和Alexa Fluor-594-綴合抗兔IgG（1∶800）于37℃避光孵育1 h，DAPI 溶液復染細胞核5 min，貼于載玻片并以抗熒光淬滅劑封片，高倍顯微鏡（400×）下拍照。

1.8 Western blot 檢測

每組剩余6 只大鼠取缺血半影區腦組織研磨勻漿后RIPA 緩沖液處理40 min。4℃下12 000 r/min 離心15 min 取上清液，離心半徑8 cm。SDS-PAGE 凝膠電泳后轉膜至PVDF 膜，10%脫脂牛奶封閉2 h 后PBST 洗滌，再用LC3（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）、Beclin-1 和β-actin（1∶1 000）-4℃孵育過夜。洗滌后，將膜與山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶酶標抗體（1∶5 000）室溫下孵育1 h，與電致化學發光試劑結合后通過BIO-RAD系統曝光拍照，條帶的光密度通過Image J 軟件進行定量分析。

1.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組神經功能比較

模型組mNSS 高于假手術組，雷帕霉素組低于模型組，3-甲基腺嘌呤組高于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖1。

圖1 四組神經功能比較（n=6）

2.2 四組腦梗死體積占比比較

模型組腦梗死體積占比高于假手術組，雷帕霉素組低于模型組，3-甲基腺嘌呤組高于模型組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見圖2。

圖2 四組腦梗死體積占比比較（n=6）

2.3 四組腦缺血半影區自噬相關指標表達比較

熒光染色及定量分析結果顯示，模型組LC3 陽性細胞占比高于假手術組，雷帕霉素組高于模型組，3-甲基腺嘌呤組低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05或P ＜0.01）。Western blot 結果顯示，模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平高于假手術組，雷帕霉素組高于模型組，3-甲基腺嘌呤組低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖4。

圖4 四組腦缺血半影區自噬相關指標表達比較（n=6）

2.4 四組缺血半影區NeuN 陽性細胞占比比較

免疫熒光檢測及定量分析結果顯示，模型組缺血半影區NeuN 陽性細胞占比低于假手術組，雷帕霉素組高于模型組，3-甲基腺嘌呤組低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖5。

3 討論

腦缺血發生后缺血半影區內神經細胞自噬被顯著激活[12]，但自噬是神經元存活的一把雙刃劍，其神經保護作用仍有爭議[13]。誘導適度自噬可增加神經元存活率，改善腦缺血后神經功能損傷，但抑制自噬則加重神經元死亡[14-16]。但抑制缺血性腦卒中后的自噬發生也可減少腦缺血再灌注后的梗死體積，因此認為神經元過度自噬將導致細胞死亡[17]。此結果可能由多種原因引起，包括腦缺血區域、缺血持續時間、干預藥物劑量的不同等[18-20]，其中藥物干預時間的不同可能是自噬活性差異的重要原因[21]。自噬發生后Beclin-1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可用于評估腦卒中后的自噬水平，LC3 前體分子裂解形成LC3-Ⅰ后被激活并偶聯，以LC3-Ⅱ的形式附著到自噬體膜，與Beclin-1 一同升高[22-24]。本研究發現，模型組缺血半影區Beclin-1 及LC3 均有較高表達水平，且該區域內神經元數目減少，大鼠大腦大面積梗死并表現出一定程度的神經缺損障礙。自噬誘導劑雷帕霉素干預后該區域自噬水平增加，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤則出現相反結果。本研究結果顯示，自噬誘導增加了大鼠腦缺血半影區神經元存活，自噬抑制則表現出相反作用。這些結果提示，自噬誘導劑在左側大腦中動脈閉塞的亞急性期可提供神經保護作用，但自噬抑制則加重神經損傷。

綜上，大鼠缺血性腦卒中亞急性期可能存在自噬不足，適當自噬激活有利于神經修復，及時接受溶栓或手術治療的患者應該在腦卒中后期可適當誘導自噬[25]。相反，自噬抑制劑造成的自噬不足加重了腦缺血損傷及神經功能障礙[26-27]。自噬激活可增加大鼠腦缺血再灌注亞急性期神經保護，為臨床亞急性期缺血性腦卒中患者的治療提供一定理論基礎。